Kolorimetrischer Assay zur Quantifizierung von Laktat in Testproben

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Yanase, S., et al. Kleinskalige kolorimetrische Assays von intrazellulärem Laktat und Pyruvat im Fadenwurm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt einen kolorimetrischen Assay zur Laktatmessung in Zelllysaten unter Verwendung des Enzyms Laktatdehydrogenase. Dieses Enzym wandelt Laktat in Pyruvat um, zusammen mit der Umwandlung von NAD in NADH, das mit Tetrazoliumfarbstoffen reagiert und ein farbiges Produkt ergibt, das spektrophotometrisch gemessen werden kann, um das Laktat zu quantifizieren.

Protokoll

1. Synchronisierte Kultur von C. elegans

Vor der Aussaat wird der Escherichia coli (E. coli) Stamm OP50 über Nacht bei 37 °C in 300 ml flüssigem Luria-Bertani (LB)-Bouillon kultiviert. Lagern Sie das kultivierte OP50 bei -4 °C.
1. Um LB-Brühe flüssiges Medium herzustellen, verwenden Sie 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl und 1,5 ml 1 N NaOH und fügen Sie es mit deionisiertem Wasser zu 1 l hinzu. Autoklav.
  Anmerkung: OP50- und C. elegans-Stämme sind beim Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, St. Paul, MN, USA) erhältlich.
Zur Herstellung vo....

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Ergebnisse

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Abbildung 1. Verfahren zur Extraktion zellulärer Metaboliten. (A) 1.500-3.000 Würmer wurden auf eine NGM-Agarplatte (90-mm-Petrischale) gelegt. Die Extraktion aus Würmern auf fünf Platten war für die kolorimetrischen Assays ausreichend. (B) Würmer, die von den fünf Platten mit 3.000 bzw. 1.500 Würmern pro Platte entnommen wurden, sind auf der link.......