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1. Synchronisierte Kultur von C. elegans
- Vor der Aussaat wird der Escherichia coli (E. coli) Stamm OP50 über Nacht bei 37 °C in 300 ml flüssigem Luria-Bertani (LB)-Bouillon kultiviert. Lagern Sie das kultivierte OP50 bei -4 °C.
- Um LB-Brühe flüssiges Medium herzustellen, verwenden Sie 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl und 1,5 ml 1 N NaOH und fügen Sie es mit deionisiertem Wasser zu 1 l hinzu. Autoklav.
Anmerkung: OP50- und C. elegans-Stämme sind beim Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, St. Paul, MN, USA) erhältlich.
- Zur Herstellung von Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)-Agar verwenden Sie 3 g NaCl, 2,5 g Pepton, 17 g Agar und 975 ml deionisiertes Wasser. Autoklav. Auf 55 °C abkühlen lassen und dann steril 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 5 mg/ml Cholesterin in EtOH und 25 ml 1 M Kaliumphosphat pH 6,0 in 90-mm-Petrischalen hinzufügen.
- Für 1 M Kaliumphosphat pH 6,0 verwenden Sie 108,3 g KH2PO4 und 46,6 g K2HPO4 und fügen Sie deionisiertes Wasser in 1 l Autoklav hinzu.
- Verteilen Sie 1-2 ml des kultivierten OP50 auf die NGM-Agarplatten. Um eine dünne Schicht OP50 herzustellen, inkubieren Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur, bevor Sie Nematoden hinzufügen.
Anmerkung: Die NGM-Agarplatten inokuliert OP50 können 2-3 Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
- Geben Sie mindestens 100 Würmer auf eine NGM-Agarplatte mit OP50 und kultivieren Sie sie bei 20 °C bis zum Erwachsenenstadium. Es werden mindestens drei Platten benötigt.
- Um Eier in utero zu sammeln, übertragen Sie trächtige Hermaphroditen aus den drei NGM-Agarplatten mit jeweils 5 ml S-Puffer in ein konisches 15-ml-Röhrchen und waschen Sie die Würmer 3 Mal mit 15 ml S-Puffer durch Zentrifugation bei 300 x g für 30 s bei Raumtemperatur.
- Um S-Puffer herzustellen, verwenden Sie 5,9 g NaCl und 50 ml 1 M Kaliumphosphat pH 6,0 und fügen Sie es mit deionisiertem Wasser zu 1 l hinzu. Autoklav.
- Löse die Würmer in einer alkalischen Hypochloritlösung zur Axenisierung und Isolierung von Eiern auf (0,5 ml frisches Bleiche oder Äquivalent: 5-6% Natriumhypochlorit, 0,1 ml 10 M NaOH, ca. 4,5 ml S-Puffer) und ziehe die Lösung 10-15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Mischen durch Invertieren.
Anmerkung: Innerhalb von 15 Minuten sollten sich die adulten Würmer auflösen und eine trübe Lösung der aus ihren Kadavern freigesetzten Eier hinterlassen (die freigesetzten Eier sollten mit einem stereoskopischen Mikroskop bestätigt werden). Anstelle von 0,1 mL 10 N NaOH können auch 0,2 mL 5 N NaOH verwendet werden.
- Waschen Sie das Eipellet nach der Hypochloritbehandlung 3 Mal mit 15 mL S-Puffer und resuspendieren Sie es in 5-6 mL S-Puffer. Die freigesetzten Eier werden während einer Inkubation über Nacht bei 20 °C in S-Puffer ohne E. coli ausgebrütet, um eine alterssynchrone Kultur von Larven im L1-Stadium durchzuführen.
- Um die ungefähre Anzahl der Larven im L1-Stadium zu bestimmen, zählen Sie die Würmer mit einem stereoskopischen Mikroskop in 10 μl S-Puffer, nachdem Sie die Larven mindestens 3 Mal resuspendiert haben, und berechnen Sie den Mittelwert. Dann werden die Larven des L1-Stadiums auf fünf NGM-Agarplatten mit OP50 (1.500-3.000 Würmer pro Platte mit einer 90-mm-Petrischale) umgefüllt und bei 20 °C kultiviert, bis sie bis zum Stadium des jungen Erwachsenen herangewachsen sind, wenn die Selbstbefruchtung beginnt und einige Eier gelegt werden (normalerweise nach 3 Tagen).
2. Extraktion der zellulären Fraktion aus C. elegans
- Sammeln Sie die Würmer im jungen Erwachsenenstadium (5 Tage alte Tiere) von den fünf NGM-Agarplatten mit S-Puffer (Abbildung 1A).
- Um nur lebende Würmer unter Verwendung der Saccharosemethode 6 für die Flotation mit 30 % (w/v) Saccharose auszuwählen, mischen Sie die in 3-4 ml S-Puffer suspendierten Würmer mit einem gleichen Volumen eiskalter 60 % (w/v) Saccharose in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Schleudern Sie das Röhrchen bei 1.500 x g für 15 s bei 4 °C und entfernen Sie die schwimmenden Würmer in ein frisches Röhrchen, indem Sie sie mit einer Pasteur-Pipette von der Wand des Röhrchens entfernen.
- Waschen Sie die Würmer 3 Mal mit S-Puffer durch Zentrifugation bei 1.500 x g für 30 s bei 4 °C. Überprüfen Sie das Nassvolumen der gewaschenen Würmer nach der Zentrifugation mit einer 1.000-μl-Mikropipettenspitze (Abbildung 1B).
- Geben Sie die gewaschenen Würmer zu einem gleichen Volumen eiskalter 10 % (w/v) Trichloressigsäure (TCA; Endkonzentration von 5 %) für die Proteinfällung (Abbildung 1C). Anstelle von TCA kann Perchlorsäure (PCA) oder Metaphosphorsäure verwendet werden.
- Homogenisieren Sie die Würmer mit dem Fällungsmittel mit 40 Hüben eines Stößels in einem Teflon-Homogenisator (Potter-Elvehjem Tissue-Grinder) mit einer Rotation von bis zu 1.300 U/min auf Eis.
- Übertragen Sie das Homogenat mit einer Pasteur-Pipette in ein frisches 1,5-ml-Mikroröhrchen und beschallen Sie es mit einem Ultraschall-Homogenisator für 3 Minuten (3 Mal von 1 min) mit einer Einschaltdauer von 20 % auf Eis.
- Das Homogenat wird durch Zentrifugation bei 8.000 x g für 10 min bei 4 °C geklärt. Die Überstände werden mit 4 M KOH (0,25 Volumenprozent zu 10 % TCA) für 20 min auf Eis neutralisiert und bei 8.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand (als Testprobe) kann bis zu den folgenden Assays bei -80 °C gelagert werden.
3. Laktat-Assay mit einem kolorimetrischen Assay-Kit
- Messen Sie die Laktatkonzentration in den Testproben mit einem kolorimetrischen Assay-Kit (Materialtabelle). Führen Sie Duplex-Untersuchungen für die Prüfmuster durch. Geben Sie 5 oder 10 μl der Testproben auf eine 96-Well-Platte und stellen Sie das Volumen mit dem im Kit enthaltenen Laktat-Assay-Puffer auf 50 μl pro Well ein.
- Für die Laktat-Standard-Kurve verdünnen Sie 100 mM L(+)-Laktat-Standard auf 1 mM mit Lactate Assay Buffer. Geben Sie 0, 2, 4, 6, 8 und 10 μl des 1 mM L(+)-Lactatstandards, der mit dem Kit geliefert wird, in eine Reihe von Vertiefungen.
- Geben Sie 50 μl Reaktionsmischung (bestehend aus 46:2:2 Laktat-Assay-Puffer, Laktat-Enzym-Mix und Laktatsonde in DMSO, wasserfrei; alle Reagenzien sind im Kit enthalten) oder Hintergrund-Kontroll-Mix (enthält 48:2 Laktat-Assay-Puffer und Laktatsonde) in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 30-60 Minuten lang bei Raumtemperatur, während die Proben vor Licht geschützt sind.
- Messen Sie die Absorption jeder Vertiefung bei 570 nm mit einem Mikroplatten-Reader und subtrahieren Sie die Absorption des Hintergrundkontrollmixes von der Absorption des Reaktionsmixes.
- Zeichne die Laktat-Standardkurve. Berechnen Sie die Laktatkonzentrationen der Prüflinge aus der Laktat-Normkurve.
