Spektrophotometrischer Assay zur Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität

Zusammenfassung

Quelle: Wilson W.A., Spektrophotometrische Methoden zur Untersuchung des eukaryotischen Glykogenstoffwechsels. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video beschreibt einen spektrophotometrischen Assay zur Abschätzung der Glykogensynthase-Aktivität. Die Methode beruht auf der Verringerung der Absorption von NADH mit der Zeit und zeigt die Aktivität der Glykogensynthase an.

Protokoll

1. Bestimmung der Glykogensynthase-Aktivität

1. Bereiten Sie Stammlösungen der erforderlichen Reagenzien vor, wie in Tabelle 1 angegeben (vor dem Versuchstag).
2. Bereiten Sie am Tag des Assays eine frische Arbeitslösung von 4 mM NADH her, indem Sie 4,5 mg NADH in 1,5 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, auflösen. Auf Eis vor Licht geschützt lagern.
3. Stammlösungen von UDP-Glucose, ATP, Phosphoenolpyruvat und NDP-Kinase auf Eis auftauen.
4. Ein Wasserbad auf 30 °C vorheizen.
5. Richten Sie jeden Glykogensynthase-Assay in einem 1,5-ml-Röhrchen ein, indem Sie die in Tabelle 2.<br /> aufgeführten Reaktionsgemischreagenzien hinzufügen Anmerkung: Um die Einrichtung zu erleichtern, kann ein Mastermix hergestellt werden, der genügend von jedem der oben aufgeführten Reagenzien enthält, um die Anzahl der geplanten Assays zu vervollständigen.
6. Bereiten Sie eine Blindreaktion vor, bei der das NADH in der obigen Mischung durch Wasser ersetzt wird. In eine Einwegküvette aus Methacrylat umfüllen und mit dieser den Nullpunkt auf dem Spektralphotometer auf 340 nm einstellen.
7. Es werden 770 μl des aliquoten Reaktionsgemisches in ein 1,5-ml-Röhrchen gegeben. 2 μl NDP-Kinase und 2 μl Pyruvatkinase/Lactat-Dehydrogenase-Gemisch zugeben, vorsichtig mischen und 3 min bei 30 °C inkubieren, um das Reaktionsgemisch vorzuwärmen.
8. 30 μl der Probe, die Glykogensynthase enthält, in 20 mM Tris-Puffer, pH 7,8, zugeben, mischen und das Reaktionsgemisch in eine Einweg-Methacrylatküvette überführen.
9. Die Küvette wird in das Spektralphotometer eingesetzt und die Extinktion bei 340 nm in zeitlich festgelegten Intervallen für 10 bis 20 min aufgezeichnet. Die erhaltenen Extinktionen werden in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen
   Anmerkung: Eine Reaktion, bei der die Glykogensynthase-Probe durch 20 mM Tris-Puffer ersetzt wird, sollte durchgeführt werden, um die nicht-enzymatische Oxidation von NADH zu kontrollieren. Abhängig von der Reinheit der Probe können weitere Kontrollreaktionen erforderlich sein.
10. Bestimmen Sie die Reaktionsgeschwindigkeit.

Tabelle 1: Stammlösungen, die für den Assay der Glykogensynthase-Aktivität benötigt werden.

Bestandteil	Wegbeschreibung
50 mM Tris pH 8,0	Lösen Sie 0,61 g Tris-Base in ~ 80 mL Wasser. Auf 4 °C kühlen. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 8,0 ein und erhöhen Sie das Volumen mit Wasser auf 100 mL.
20 mM HEPES-Puffer	0,477 g HEPES in ~ 80 mL Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,0 ein und füllen Sie das Volumen mit Wasser auf 100 mL auf.
132 mM Tris/32 mM KCl-Puffer pH 7,8	Lösen Sie 1,94 g Tris-Base und 0,239 g KCl in ~90 mL Wasser. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,8 ein und füllen Sie das Volumen mit Wasser auf 100 mL auf.
0,8 % w/v Austernglykogen	80 mg Austernglykogen abwiegen und ins Wasser geben. Erhöhen Sie das endgültige Volumen mit Wasser auf 10 mL und erwärmen Sie es vorsichtig/mischen Sie, um das Glykogen vollständig aufzulösen.
100 mM UDP-Glukose	Lösen Sie 0,31 g UDP-Glukose in Wasser auf und erhöhen Sie das Endvolumen auf 1 ml. In Aliquots lagern, eingefroren bei -20 °C. Mehrere Monate haltbar.
50 mM ATP	Löse 0,414 g ATP in ~ 13 mL Wasser auf. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,5 ein und füllen Sie das Volumen mit Wasser auf 15 mL auf. In Aliquoten bei -20 °C eingefroren lagern. Mehrere Monate haltbar.
100 mM Glukose-6-phosphat pH 7,8	0,282 g Glucose-6-phosphat in ~ 7 bis 8 mL Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,8 ein. Erhöhen Sie das Volumen mit Wasser auf bis zu 10 ml. Tiefgekühlt in Aliquoten bei -20 °C lagern. Mindestens sechs Monate haltbar.
40 mM Phosphoenolpyruvat	Lösen Sie 4 mg Phosphoenolpyruvat in 0,5 ml 20 mM HEPES-Puffer pH 7,0. Bei -20 °C lagern. Mindestens 1 Woche haltbar.
0,5 M MnCl2	Löse 9,90 g MnCl2 in einem Endvolumen von 100 ml Wasser auf.
NDP-Kinase	Rekonstituiert lyophilisiertes Pulver mit ausreichend Wasser, um 1 U/μl Lösung zu erhalten. Aliquote herstellen, in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern. Mindestens 1 Jahr haltbar.

Tabelle 2: Zusammensetzungsreaktionsgemisch für den Assay der Glykogensynthase-Aktivität.

Bestandteil	Volumen (μl)
160 mM Tris/32 mM KCl-Puffer pH 7,8	250
Wasser	Nr. 179
100 mM Glukose-6-phosphat, pH 7,8	58
0,8 % w/v Austernglykogen	67
50 mM ATP	80
4 mM NADH	80
100 mM UDP-Glukose	28
40 mM Phosphoenolpyruvat	20
0,5 M MnCl2	8
Letzter Band	770

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Amylopektin (amylosefrei) aus Wachsmais	Fisher Scientific	Nr. A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, Dinatriumsalz	MilliporeSigma	Nr. A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphat, Kaliumsalz	MilliporeSigma	Nr. G6893
D-Glukose-6-phosphat, Natriumsalz	MilliporeSigma	Nr. G7879
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Grad I, aus Hefe	MilliporeSigma	10127655001
Glykogen, Typ II aus der Auster	MilliporeSigma	Nr. G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Methacrylat-Küvetten, 1,5 mL	Fisher Scientific	Tel.: 14-955-128	Methacrylat ist erforderlich, da einige Verfahren bei 340 nm oder darunter durchgeführt werden
β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat-Natriumsalz	MilliporeSigma	Nr. N0505
β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid, reduziertes Dinatriumsalz	MilliporeSigma	Artikel-Nr.: 43420
Nukleosid-5'-Diphosphatkinase	MilliporeSigma	Nr. N0379
Phosphoenolpyruvat, Monokaliumsalz	MilliporeSigma	Nr. P7127
Phosphoglucomutase aus Kaninchenmuskel	MilliporeSigma	Nr. P3397
Phosphorylase A aus Kaninchenmuskel	MilliporeSigma	Nr. P1261
Pyruvat-Kinase/Milchsäuredehydrogenase-Enzyme aus Kaninchenmuskeln	MilliporeSigma	Nr. P0294
UDP-Glukose, Dinatriumsalz	MilliporeSigma	Nr. U4625