HINWEIS: Bewahren Sie die Platten während aller Experimente immer auf nicht-elektrostatischen Oberflächen auf, wie z.B. die Papierverpackungen von der Verpackung. Befolgen Sie Abschnitt 1 unten, um die am besten geeignete Konzentration von Zellen zu bestimmen, die in die elektronische Mikrotiterplatte (als E-Platte konzipiert) ausgesät werden sollen.
1. Bestimmung der geeigneten Zellmenge für die Infektion von Zellen
- Bereiten Sie MDCK-Zellen (Madin-Darby Canine Kidney) in 75 cm2 Flaschen vor, um 24 h vor dem Experiment frisch gespaltene Zellen (ca. 80 % Konfluenz) zu erhalten.
- Waschen Sie die Zellen mit 5 mL 1x PBS und lösen Sie sie durch Zugabe von 3 mL 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung.
- Fügen Sie 7 ml frisches Zellkulturmedium hinzu und zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler mit Trypanblau-Färbung.
- Stellen Sie die Zellkonzentration mit Zellkulturmedien auf 400.000 Zellen/ml ein. Führen Sie zweifache serielle Verdünnungen in zusätzlichen Röhrchen durch, um eine Zelldichte von 200.000 zu erhalten; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; und 6.250 Zellen/ml. Passen Sie den Verdünnungsbereich der Zellen entsprechend dem Zelltyp und ihrem Wachstumsverhalten an.
- Lassen Sie die E-Platte (Table of Materials) einige Minuten lang bei RT und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl Zellkulturmedium in jede Vertiefung. Berühren Sie nicht die Elektroden der E-Plate.
- Entriegeln Sie die Halterungen und stecken Sie das vordere Ende der Platte in die Halterungstasche des Impedanzmessgeräts (Materialtabelle). Schließen Sie die Tür des Inkubators.
- Öffnen Sie die Software.
- Wählen Sie unter "Standardeinrichtung des Testmusters" die ausgewählte(n) Dockingstation(en) aus, doppelklicken Sie auf die obere Seite und geben Sie dann den Namen des Experiments ein. Klicken Sie auf "Layout" und geben Sie die erforderlichen Probeninformationen für jede ausgewählte Vertiefung der Platte ein. Klicken Sie dann auf "Übernehmen", wenn Sie fertig sind. Klicken Sie auf "Zeitplan" | "Schritte" | "Schritt hinzufügen". Die Software fügt automatisch einen Schritt von 1 s hinzu, um die Hintergrundimpedanz (CI) zu messen.
- Klicken Sie auf "Start/Weiter" im Reiter "Ausführen". Klicken Sie auf "Plotten", fügen Sie alle Proben hinzu, indem Sie die entsprechenden Vertiefungen auswählen, und stellen Sie sicher, dass das CI zwischen -0,1 und 0,1 liegt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Nehmen Sie die Platte aus der Halterung.
- 100 μl jeder Zellsuspension aus Schritt 1.4 werden in zweifacher Ausfertigung in die entsprechenden Vertiefungen und 100 μl Zellmedien in Vertiefungen gegeben, die als Kontrollen verwendet werden. Lassen Sie die E-Platte 30 Minuten lang bei RT in der Laminar-Flow-Haube, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen am Boden der Wells zu ermöglichen.
- Setzen Sie die E-Plate in die Halterungstasche ein. Klicken Sie in der Software auf "Zeitplan" | "Schritt hinzufügen" und geben Sie Werte ein, um die Zellen alle 30 Minuten für 200 Wiederholungen zu überwachen. Wählen Sie dann "Start/Weiter".
- Überprüfen und plotten Sie die CI-Daten, indem Sie in der Software auf die Schaltfläche "Plotten" klicken. Wählen Sie die Konzentration von Zellen, die sich 24 h nach der Aussaat auf der Platte kurz vor der stationären Phase befinden, um Zellen zu erhalten, die sich während der Virusinfektion noch in einer Wachstumsphase befinden. Die stationäre Phase ist erreicht, wenn das CI am Maximum ist.