Impedanzbasierter zellulärer Assay zur Messung der Vielzahl von Infektionen mit Influenzaviren

Zusammenfassung

Quelle: Labadie, T., et al., Überwachung des Überlebens von Influenzaviren außerhalb des Wirts mittels Echtzeit-Zellanalyse. J. Vis. exp. (2021)

In diesem Video diskutieren wir die Korrelation zwischen dem CIT₅₀ und der Vielzahl von Virusinfektionen. Die virusinfizierten Zellen zeigen zytopathische Wirkungen, die zu ihrem Tod und ihrer Ablösung von der Goldmikroelektrode führen, was wiederum die Impedanz verringert.

Protokoll

1. Korrelation zwischen CIT_50-Werten und der Vielzahl der Infektionen

1. Geben Sie 100 μl steriles 1x MEM-Kulturmedium in jede Vertiefung der E-Platte. Setzen Sie die E-Plate bei 35 °C in die Halterungstasche des Instruments ein.
2. Messen Sie den Hintergrund wie beschrieben:
3. Öffnen Sie die Software.
   1. Wählen Sie unter "Standardeinrichtung des Testmusters" die ausgewählte(n) Dockingstation(en) aus, doppelklicken Sie auf die obere Seite und geben Sie dann den Namen des Experiments ein. Klicken Sie auf "Layout" und geben Sie die erforderlichen Probeninformationen für jede ausgewählte Vertiefung der Platte ein. Klicken Sie dann auf "Übernehmen", wenn Sie fertig sind. Klicken Sie auf "Zeitplan" | "Schritte" | "Schritt hinzufügen". Die Software fügt automatisch einen Schritt von 1s hinzu, um die Hintergrundimpedanz (CI) zu messen.
   2. Klicken Sie auf "Start/Weiter" auf der Registerkarte "Ausführen". Klicken Sie auf "Plotten", fügen Sie alle Proben hinzu, indem Sie die entsprechenden Vertiefungen auswählen, und stellen Sie sicher, dass das CI zwischen -0,1 und 0,1 liegt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
4. Entfernen Sie die E-Plate aus der Halterung.
5. Säen Sie 3 x 10⁴ frisch gespaltene MDCK-Zellen auf jede Vertiefung der elektronischen Mikrotiterplatte und züchten Sie sie 24h lang bei 35°C mit 5% CO₂, so dass sie sich während der IAV-Infektion in einer replikativen Phase befinden.
6. Infizieren Sie MDCK-Zellen mit unterschiedlichen 10-fachen Verdünnungen eines bekannten 6log₁₀TCID₅₀/ml-Titers des H1N1-Virus, indem Sie das Rückwärtspipettieren zur Reproduzierbarkeit verwenden, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:
   1. Spülen Sie MDCK-Zellen 2x mit 100 μl MEM ohne FCS (Virusvermehrungsmedien). Achten Sie darauf, nach dem zweiten Waschen alle Medien zu entfernen, um eine weitere Verdünnung des Inokulums zu vermeiden.
   2. Geben Sie 100 μl Virussuspension mit einer Einkanalpipette in jede Vertiefung. Um eine Kontamination zu vermeiden, beginnen Sie von links nach rechts und dann von oben nach unten in der Platte, während Sie die verbleibenden Vertiefungen mit dem Deckel abdecken.
   3. Setzen Sie die Platte bei 35 °C in die Halterungstasche des Instruments ein. Seien Sie vorsichtig, um plötzliche Bewegungen zu vermeiden, die zu einer Kontamination führen können.
   4. Beginnen Sie mit der Überwachung der Zellimpedanz alle 15 Minuten während mindestens 100 Stunden, wie beschrieben:
      1. Setzen Sie die E-Plate in die Halterungstasche ein. Klicken Sie in der Software auf "Zeitplan" | "Schritt hinzufügen" und geben Sie Werte ein, um die Zellen alle 30 Minuten für 200 Wiederholungen zu überwachen. Wählen Sie dann "Start/Weiter".
   5. Nach den beiden Messzyklen (d. h. 30 Minuten) pausieren Sie das Gerät, indem Sie auf der Registerkarte "Ausführen" auf "Pause" klicken und die E-Platte aus der Halterung entfernen.
   6. Geben Sie 1 μg/ml TPCK-Trypsin in das Virusvermehrungsmedium, um das virale Hämagglutinin zu spalten.
   7. Geben Sie 100 μl Virusvermehrungsmedien, das TPCK-Trypsin enthält, in jede Vertiefung und setzen Sie die E-Platte in die Halterungstasche ein.
   8. Klicken Sie auf "Start/Weiter" im Reiter "Ausführen".
      Anmerkung: Vergessen Sie nicht, eine Negativkontrolle für scheininfizierte Zellen zu erstellen, indem Sie die Virussuspension durch Virusvermehrungsmedien ersetzen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
E-Plate 16 (6 Platten)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	E-Platten sind in verschiedenen Verpackungen erhältlich
MEM 1X	Lebenstechnologien (gibco)	31095029
TPCK-Trypsin	Worthington	LS003740
xCELLigence Echtzeit-Zellanalysegerät S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	Die xCELLigence RTCA S16 Geräte sind in verschiedenen Formaten erhältlich (16-Well, 96-Well, Single- oder Multi-Plate)