Zellulärer impedanzbasierter Überlebenskinetik-Assay zur Beurteilung des Überlebens von Viren

Zusammenfassung

Quelle: Labadie, T. et al., Überwachung des Überlebens von Influenzaviren außerhalb des Wirts mittels Echtzeit-Zellanalyse. J. vis. exp. (2021).

Dieses Video beschreibt eine zelluläre Impedanz-basierte Technik, um die Überlebenskinetik von Viren zu untersuchen, die zytopathische Effekte induzieren. Die Methode misst die elektrische Impedanz von virusinfizierten adhärenten Zellen, die mit Kochsalzlösung vorbehandelt wurden.

Protokoll

1. Vorbereitung von Reagenzien und Ausgangsmaterialien

1. Aufbereitung von MDCK-Zellen und sterilem Zellkulturmedium
   1. Kultivieren Sie Madin-Darby-Zellen der Hundeniere (MDCK) in modifiziertem Eagle-Medium (MEM), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) und Antibiotika (100 Einheiten/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin).
   2. Nach dem Auftauen durchlaufen Sie MDCK-Zellen mindestens 2x, bevor Sie sie infizieren, um eine vollständige Genesung zu gewährleisten (aber weniger als 30 Passagen, um eine Drift der Zellphänotypen zu vermeiden).
   3. 75 cm² Gewebekulturkolben mit 30 mL sterilem 1x MEM mit 7,5 x 10⁶ MDCK-Zellen aussäen und bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO₂ -Inkubator inkubieren.
2. Vorbereitung der Impedanzüberwachungsgeräte
   1. Stellen Sie das Gerät bei 35 °C in den Inkubator und lassen Sie es mindestens 2 h aufwärmen.
   2. Schließen Sie es an die Steuereinheit an, die sich außerhalb des Inkubators befindet.
   3. Fahren Sie mit den vom Hersteller empfohlenen Reinigungsverfahren fort, bevor Sie mit dem Rest des Experiments beginnen.
3. Produktion von IAV-Lagerbeständen auf MDCK-Zellen
   1. Um H1N1-Viren zu vermehren und zu amplifizieren, säen Sie 7,5 x 10⁶ MDCK-Zellen auf zwei 75 cm² Gewebekulturflaschen und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 37 °C, um eine Konfluenz von 90 % bis 100 % zu erreichen.
   2. Das Zellkulturmedium aus der Zellmonoschicht in 75 cm² Flaschen dekantieren. Waschen Sie die Zellen mit 5 mL sterilem 1x PBS.
   3. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 5 mL 1x PBS hinzu, um die Zellen erneut zu waschen.
   4. Beschriften Sie einen Kolben als Kontrolle und entfernen Sie PBS, bevor Sie vorsichtig 15 ml Virusvermehrungsmedium (1x MEM mit 0 % FCS) auf die Monoschicht geben. Dieser Kolben wird in einem Inkubator bei 35 °C mit 5 % CO₂ inkubiert. Verwenden Sie es zum Vergleich nach 3 Tagen Vermehrung.
   5. Ein Fläschchen mit IAV-Brühe bei RT auftauen. Das Virus in einem 1,5-ml-Röhrchen mit Virusvermehrungsmedium (1x MEM mit 0 % FCS) auf die entsprechende Konzentration verdünnen.
   6. Entnehmen Sie 1x PBS aus dem 75 cm² Kolben und infizieren Sie MDCK-Zellen bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 1 x ^10-3 oder 1 x ^10-4 plaquebildenden Einheiten pro Zelle (PFU/Zelle), indem Sie 1 ml des verdünnten Virus zur Zellmonoschicht hinzufügen.
   7. Adsorbieren Sie das Virus 45 Minuten lang bei RT an MDCK-Zellen, indem Sie den Kolben regelmäßig alle 15 Minuten umrühren.
   8. Entfernen Sie vorsichtig das Inokulum und fügen Sie 15 ml Virusvermehrungsmedium pro Kolben hinzu, der 1 μg/ml TPCK-Trypsin (Trypsin/L-1-Tosylamid-2-phenylethylchlormethylketon) enthält, um das virale Hämagglutinin HA0 in HA1- und HA2-Untereinheiten zu spalten (ein Ereignis, das für die HA-Fusion mit der endosomalen Membran und die Freisetzung des viralen Genoms erforderlich ist).
   9. Die Kolben werden mindestens 3 Tage lang bei 35 °C und 5 % CO₂ inkubiert, um das Virus zu vermehren.
   10. Beobachten Sie MDCK-Zellen unter einem Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung und suchen Sie nach zytopathischen Effekten (CPE) auf die Zellen (durch Vergleich mit dem Zellkontrollkolben). Wenn die CPE nicht vollständig ist (d. h. etwa 80 % der Zellen sind vom Substrat gelöst), stellen Sie die Kolben für weitere 24 Stunden in den Inkubator.
   11. Wenn CPE abgeschlossen ist, dekantieren Sie den Zellkulturüberstand und zentrifugieren Sie ihn 10 Minuten lang bei 300 x g, um die Zelltrümmer zu pelletieren.
   12. Der geklärte Überstand wird in ein 15-ml-Röhrchen überführt und die Nachkommenviren werden in sterile kryogene Einwegfläschchen überführt. Stellen Sie die Kryoröhrchen sofort bei -80 °C auf, um Viren einzufrieren und zu lagern.
4. Infizieren Sie MDCK-Zellen mit unterschiedlichen 10-fachen Verdünnungen eines bekannten 6 log₁₀ TCID₅₀/ml-Titers des H1N1-Virus, indem Sie für die Reproduzierbarkeit umgekehrtes Pipettieren verwenden, indem Sie die folgenden Schritte ausführen:
   1. Spülen Sie MDCK-Zellen 2x mit 100 μl MEM ohne FCS (Virusvermehrungsmedien). Achten Sie darauf, nach dem zweiten Waschen alle Medien zu entfernen, um eine weitere Verdünnung des Inokulums zu vermeiden.
   2. Geben Sie 100 μl Virussuspension mit einer Einkanalpipette in jede Vertiefung. Um eine Kontamination zu vermeiden, beginnen Sie von links nach rechts und dann von oben nach unten in der Platte, während Sie die verbleibenden Vertiefungen mit dem Deckel abdecken.
   3. Setzen Sie die Platte bei 35 °C in die Halterungstasche des Instruments ein. Seien Sie vorsichtig, um plötzliche Bewegungen zu vermeiden, die zu einer Kontamination führen können.
   4. Beginnen Sie mit der Überwachung der Zellimpedanz alle 15 Minuten für mindestens 100 Stunden, wie in Schritt 2.10 beschrieben.
   5. Nach den beiden Messzyklen (d. h. 30 Minuten) pausieren Sie das Gerät, indem Sie auf der Registerkarte "Ausführen" auf "Pause" klicken und die E-Platte aus der Halterung entfernen.
   6. Geben Sie 1 μg/ml TPCK-Trypsin in das Virusfortpflanzungsmedium, um das virale Hämagglutinin zu spalten.
   7. Geben Sie 100 μl Virusvermehrungsmedien, das TPCK-Trypsin enthält, in jede Vertiefung und setzen Sie die E-Platte in die Halterungstasche ein. 8. Klicken Sie im Reiter "Ausführen" auf "Start/Weiter".
      Anmerkung: Vergessen Sie nicht, eine Negativkontrolle für scheininfizierte Zellen zu erstellen, indem Sie die Virussuspension durch Virusvermehrungsmedien ersetzen.

2. IAV-Überlebenskinetik

1. Setzen Sie IAV salzhaltigem destilliertem Wasser bei 35 °C aus und testen Sie ihre Infektiosität im Laufe der Zeit, indem Sie die Abnahme der Zellimpedanz messen.
   1. Bereiten Sie salzhaltiges destilliertes Wasser vor, indem Sie NaCl bis zu einer Endkonzentration von 35 g/l in destilliertem Wasser hinzufügen. Geben Sie 900 μl Salzwasser in 2 mL Kryoröhrchen.
   2. Geben Sie 100 μl Virusmaterial in salzhaltiges Wasser und stellen Sie die Kryoröhrchen für 1 h, 24 h oder 48 h in einen Inkubator (35 °C, 5 % CO₂).
   3. 100 μl (davon 3 x 10⁴) frisch gespaltener MDCK-Zellen auf eine 16-Well-Mikrotiterplatte säen und 24 h bei 37 °C und 5 % CO₂ züchten.
   4. Infizieren Sie die Zellen mit 100 μl exponierten Viren (zuvor 10x in Kulturmedien verdünnt) unter Verwendung der umgekehrten Pipettiermethode zur Reproduzierbarkeit durch Wiederholung von Abschnitt 1.4.
2. Überwachen Sie die Impedanz der Zelle alle 15 Minuten für mindestens 100 Stunden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,25% Trypsin	ThermoFisher	25200056
75 cm2 Gewebekulturkolben	Falke	430641U
E-Plate 16 (6 Platten)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	E-Platten sind in verschiedenen Verpackungen erhältlich
Fcs	Lebenstechnologien (gibco)	Nr. 10270-106
MEM 1X	Lebenstechnologien (gibco)	31095029
PBS 1X	Lebenstechnologien (gibco)	14040091
Penicillin-Streptomycin	Lebenstechnologien (gibco)	11548876
TPCK-Trypsin	Worthington	LS003740
xCELLigence Echtzeit-Zellanalysegerät S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	Die xCELLigence RTCA S16 Geräte sind in verschiedenen Formaten erhältlich (16-Well, 96-Well, Einzel- oder Mehrplatten-Instrumente)