Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen zur Beurteilung von oxidativem Stress im Humanserum

Zusammenfassung

Quelle: Borges, C. R. et al., Bewertung des oxidativen Stresses in biologischen Proben mit dem Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanz-Assay. J. vis. exp. (2020)

Dieses Video zeigt den Thiobarbitursäure-Reaktivsubstanzen-Assay (TBARS) zur Beurteilung von oxidativem Stress in biologischen Proben.

Protokoll

Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft

1. TBARS-Assay

HINWEIS: Sobald der TBARS-Assay gestartet ist, sollte er ohne Unterbrechung beendet werden.

1. Es werden so viele Proben und Standards entnommen, die 10 Minuten lang bei 4 °C bei 1500 x g zentrifugiert wurden. Bewahren Sie nach der Zentrifugation die Glasröhrchen mit den Proben und Standards bei RT auf. Glasröhrchen nach Bedarf für die Anzahl der zu analysierenden Proben und beschriften Sie sie mit den Namen der Proben. Geben Sie dann 100 μl jeder vorbereiteten Probe (HepG2-Zelllysate, Lipoproteine niedriger Dichte, Humanserum) in jedes Glasröhrchen.
2. Geben Sie 200 μl 8,1 % SDS zu jeder Probe und jedem Standard und schwenken Sie das Glasröhrchen vorsichtig in kreisenden Bewegungen, um die Probe zu mischen.
3. Geben Sie 1,5 ml des 3,5 M Natriumacetatpuffers (pH = 4) zu jeder Probe und jedem Standard.
4. Geben Sie 1,5 ml des 3,5 M Natriumacetatpuffers (pH = 4) zu jeder Probe und jedem Standard.
5. Erhöhen Sie das endgültige Volumen auf 4 mL für jede Probe und jeden Standard, indem Sie 700 μl DI-Wasser hinzufügen.
6. Verschließen Sie jedes Glasrohr fest und inkubieren Sie es 1 h lang in einem Heizblock auf 95 °C. Decken Sie die Glasröhren mit Aluminiumfolie ab, um Kondensation an den oberen Rseiten der Röhrchen zu vermeiden.
7. Die Glasröhren aus dem Heizblock nehmen und 30 min auf Eis inkubieren.
8. Zentrifugieren Sie Proben und Standards bei 1500 x g für 10 min bei 4 °C. Bewahren Sie die Glasröhrchen mit den Proben und Standards nach dem Zentrifugieren bei RT.
   Anmerkung: Wenn die Proben auf Eis oder bei 4 °C aufbewahrt werden, fällt die gesamte Probe oder der Standard aus.
9. Unmittelbar nach der Zentrifugation aliquotieren Sie 150 μl Überstand aus jedem Röhrchen und geben Sie es in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte.
10. Entfernen Sie alle Blasen aus jeder Vertiefung mit einer Pipettenspitze.
    Anmerkung: Das Vorhandensein von Blasen führt zu inkonsistenten Absorptionswerten, was zu einer hohen Ungenauigkeit des Assays führt.
11. Lesen Sie die Absorption bei 532 nm ab. Subtrahieren Sie den durchschnittlichen Absorptionswert der Blindproben von allen anderen Absorptionswerten.
12. Erstellen Sie eine Standardkurve, indem Sie die Absorptionsmesswerte mit Blanko-Subtrahierung bei 532 nm im Vergleich zur bekannten Konzentration der einzelnen Standards darstellen. Passen Sie die Datenpunkte mithilfe der linearen Regression an. Berechnen Sie unbekannte Probenkonzentrationen unter Verwendung der Gleichung der linearen Regressionsgeraden, die aus der Standardkurve erhalten wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1x steril PBS pH 7,4 1 L	VWR, PA	101642--262	Reagenz für die Zelllyse
50 mL selbststehendes Zentrifugenröhrchen	Corning, Vereinigte Staaten von Amerika	CLS430897	Allgemeines Material
96-Well-Platte, unbehandelt, klar, mit Deckel, nicht steril	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	Zur Messung der Absorption
Amicon Ultra-0.5 100 kD Zentrifugal-Spin-Filtergerät	Fisher Scientific, NH	UFC510024	LDL-Reinigung
Verschlüsse für Glasröhren	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	Für den TBARS-Assay
Kupfer II Chlorid	SIGMA, MO	Artikel-Nr.: 222011-250G	Zur Induktion der Oxidation
Kulturröhrchen, Einweg, mit Schraubverschluss, Borosilikatglas (13 x 100 mm)	VWR, PA	Tel.: 53283-800	Für den TBARS-Assay
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)	ATCC, VA	Nr. HB-8065	HepG2-Zellmedien
Eppendorf Safe-Lock Röhrchen, 1,5 mL	eppendorf, NY	22363204	Allgemeines Material
Eppendorf Safe-Lock Röhrchen, 2,0 mL	Genesee Sceitific, Kalifornien	22363352	Allgemeines Material
Fötales Rinderserum US-Quelle	Omega Scientific, Kalifornien	FB-11	Für die Zellkultur
Eisessig	SIGMA, MO	27225-1L-R	TBARS Reagenz
Halt Proteasehemmer Cocktail (100x)	Thermo Scientific, MA	Artikel-Nr.: 87786	Reagenz für die Zelllyse
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	LDL-Lösungsmittel
Salzsäure (HCl)	Fisher Scientific, NH	Nr. A144-212	Reagenz für die Zelllyse
Legend Micro 17 Zentrifuge	Thermo Scientific, MA	75002431	Allgemeines Material
Lipoprotein niedriger Dichte, menschliches Plasma	Athen Forschung & Technologie, GA	Tel.: 12-16-120412	Prototyp einer biologischen Matrix
Magnetrührstäbchen, Octagon 6er-Sortiment	VWR, PA	Artikel-Nr.: 58948-025	Allgemeines Material
Malondialdehyd bis (Dimethylacetal)	SIGMA, MO	8207560250	TBARS Standard
Multiskan Go Mikroplatten-Spektralphotometer	Fisher Scientific, NH	51119200	Zur Messung der Absorption
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	Artikel-Nr.: 492016-100ML	Reagenz für die Zelllyse
Natriumchlorid	SIGMA, MO	Nr. S7653-1KG	Reagenz für die Zelllyse
Natriumdodecylsulfat (SDS)	SIGMA, MO	Artikel-Nr.: 436143-100G	TBARS Reagenz
Natriumhydroxid	SIGMA, MO	367176-2,5KG	TBARS Reagenz
SpeedVac Konzentrator	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	Zur Konzentration von Zelllysaten
Thiobarbitursäure	SIGMA, MO	T5500-100G	TBARS Reagenz
TRIS-Basis	Fluka, GA	Artikel-Nr.: 93362	Reagenz für die Zelllyse