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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Vorbereitung
- Fügen Sie 5 ml Penicillin/Streptomycin (10000 U/ml) und 5 ml und 10 ml handelsübliche Nahrungsergänzungsmittel zu 500 ml des kompletten klassischen Mediums mit Serum hinzu. Aliquotieren Sie zunächst 50 mL des Mediums.
Anmerkung: Geben Sie kein Medium wieder in den Bestand zurück, um eine Kontamination zu vermeiden.
- Legen Sie ein Aliquot des kompletten klassischen Mediums auf Eis.
- Verwenden Sie 70% Ethanol, um das Präpariermikroskop, die Pinzette und die Schere zu reinigen.
- Bereiten Sie zwei Zellkulturschalen (10 cm) vor, eine am Seziermikroskop und eine auf Eis; geben Sie 10 ml des kompletten klassischen Mediums in jede Schale.
2. Experimentelle Schritte (Abbildung 1)
- C57BL/6J-Mäuse um die postnatale (P) 20 herum mit 75-100 mg/kg Ketamin und 7,5 -10 mg/kg Xylazin, intraperitoneal injiziert. Halten Sie die Augen vor dem Sezieren komplett in klassischem Medium auf Eis.
- Entfernen Sie das Bindegewebe (Muskel- und Fettgewebe) und den Sehnerv am Auge.
- Schneiden Sie mit einer Mikroschere 0,5 mm posterior des Hornhautlimbus um. Entfernen Sie den Hornhaut-Iris-Komplex, den Glaskörper und die Linse.
- Machen Sie einen 1 mm Schnitt senkrecht zur Schnittkante in Richtung Sehnerv und schneiden Sie ein umlaufendes Band von 1 mm Breite ein. Trennen Sie die zentralen und peripheren Bereiche des Komplexes. Lösen Sie die Netzhaut mit einer Pinzette vom RPE/Aderhaut/Sklera-Komplex ab.
- Halten Sie das periphere Aderhautband in komplettem klassischem Medium auf Eis, isolieren Sie das andere Auge und wiederholen Sie den Vorgang, um ein zweites Band zu schneiden.
- Schneiden Sie die kreisförmige Blende in 6 ~ gleiche quadratische Stücke (~1 mm x 1 mm).
Anmerkung: Berühren Sie niemals eine Kante.
- Tauen Sie den Basalmembranextrakt (BME) gemäß den Anweisungen des Herstellers auf. Geben Sie 30 μl/Vertiefung BME in die Mitte jeder Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Stellen Sie sicher, dass das Tröpfchen BME eine konvexe Kuppel am Boden der Platte bildet, ohne die Ränder zu berühren.
Anmerkung: Tauen Sie den BME über Nacht im Kühlschrank auf. BME sollte nach dem Auftauen jederzeit auf dem Eis sein.
- Platzieren Sie das Gewebe in der Mitte des BME.
Anmerkung: Glätten Sie die Aderhautexplantation nicht; Lassen Sie das Gewebe im Allgemeinen innerhalb des BME expandieren. Die Ausrichtung des Gewebes (Skleralseite nach oben oder unten) hat keinen Einfluss auf das Versuchsergebnis.
- Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei 37 °C, damit sich das Gel verfestigen kann.
- Geben Sie 500 μL des kompletten klassischen Mediums/Wells hinzu.
- Wechseln Sie das klassische Medium jeden zweiten Tag (500 μL). Das Keimen der Aderhaut kann nach 3 Tagen mit dem Mikroskop beobachtet werden.
Anmerkung: Für die Behandlung mit Wachstumsfaktoren hungern Sie das Gewebe für 4 Stunden. Verdünnen Sie eine Versuchssubstanz in einem wachstumsfaktorreduzierten Medium (1:200 Boost statt 1:50).
3. SWIFT-Choroid computergestützte Quantifizierungsmethode (Abbildung 2)
HINWEIS: Es wurde eine computergestützte Methode verwendet, um die Fläche zu messen, die von Zuchtgefäßen abgedeckt wird. Vor der Quantifizierung ist ein Makro-Plugin für die ImageJ-Software erforderlich.
- Öffnen Sie das Aderhautbild mit ImageJ und aktivieren Sie "Bild |Typ| 8-Bit" mit Graustufen.
- Gehen Sie zu "Bild | Anpassen | Helligkeit/Kontrast (Strg/Shift/ C)" und optimieren Sie den Kontrast.
- Verwenden Sie die Zauberstab-Funktion, um das Aderhautgewebe, das in der Mitte der Sprossen vorhanden ist, zu umreißen und aus dem Bild zu entfernen (mit der Tastenkombination "F1") (Abbildung 2A, B).
Anmerkung: Stellen Sie die Toleranzrate des Zauberstabs auf 20-30% ein.
- Entfernen Sie den Hintergrund des Bildes mit den freien Auswahlwerkzeugen (Abbildung 2C). Gehen Sie zu "Bild | Anpassen | Schwellenwert (Strg/Umschalt/T)". Verwenden Sie die Schwellenwertfunktion, um die mikrovaskulären Sprossen vor dem Hintergrund und der Peripherie zu definieren (Abbildung 2D).
- Klicken Sie auf "F2" und eine Zusammenfassung wird angezeigt. Speichern Sie ein Bild des ausgewählten Bereichs, indem Sie auf "Speichern" klicken. Speichern Sie es im selben Ordner wie das Originalbild zum späteren Nachschlagen.
- Nachdem eine Gruppe von Proben gemessen wurde, kopieren Sie die aufgezeichneten Proben für die Datenanalyse.
Anmerkung: Es ist auch möglich, die Fläche (μm²) mit der Option "Analysieren | "Maßstab festlegen" mit Bildern mit Maßstabsbalken.
