1. Transfektionsassay für humane Östrogenrezeptoren β
HINWEIS: Für Tag 1 des Assay-Protokolls sind eine aseptische Technik und eine Laminar-Flow-Haube erforderlich.
- Verdünnungen von 17β-Östradiol für die Standardkurve vorbereiten.
- Übertragen Sie das Zellrückgewinnungsmedium und das Compound Screening Medium (CSM) aus dem Gefrierlager und tauen Sie sie in einem 37 °C warmen Wasserbad auf.
- Mikrozentrifugenröhrchen Intermediate 1 und 2 (INT1, INT2) und 1-8 beschriften.
- Füllen Sie INT1 mit 995 μl CSM, INT2 mit 615 μl CSM, Röhrchen 1 mit 900 μl CSM und Röhrchen 2-8 mit 600 μl CSM. Tube 8 beiseite stellen.
- 5 μl 100 μM 17β-Östradiol-Stamm in INT1 überführen. Werfen Sie das Trinkgeld weg. Wirbel.
- Spülen Sie die Pipette vor jedem Transfer 3 Mal und übertragen Sie dann 10 μl von INT1 in INT2. Werfen Sie das Trinkgeld weg.
- Spülen Sie die Pipette 3 Mal aus und übertragen Sie dann 100 μl von INT2 in Röhrchen 1. Tipp wegwerfen. Übertragen Sie 300 μl aus Röhrchen 1 in Röhrchen 2. Wiederholen Sie dies für die Röhrchen 3 bis 7. Entsorgen Sie 300 μl aus Röhrchen 7 in den Abfallbehälter. Röhre 8 ist eine Null und erhält kein Östradiol. Die endgültigen Konzentrationen der plattierten Standards sind: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 und 0 pM Östradiol.
- Bereiten Sie Probenverbindungen vor.
- Vortex-Proben.
- Nehmen Sie 4 μl jeder Pflanzenprobe in DMSO und fügen Sie sie zu 496 μl CSM hinzu, um eine 0,8%ige DMSO-Lösung zu erhalten.
- Tauen Sie Reporterzellen schnell auf.
- Nehmen Sie den Schlauch mit dem Cell Recovery Medium aus dem 37 °C warmen Wasserbad. Desinfizieren Sie die Außenfläche mit 70% Ethanol.
- Entnehmen Sie Reporterzellen aus einer Lagerung bei -80 °C und tauen Sie sie auf, indem Sie 10 mL des vorgewärmten CRM in das Röhrchen mit gefrorenen Zellen übertragen.
- Verschließen Sie das Röhrchen mit den Reporterzellen und geben Sie sie für 5-10 Minuten in ein 37°C heißes Wasserbad.
- Nehmen Sie das Röhrchen mit der Reporterzellsuspension aus dem Wasserbad. Drehen Sie das Zellröhrchen mehrmals vorsichtig um, um Zellaggregate aufzubrechen und eine homogene Suspension zu erzeugen. Reinigen Sie die Oberfläche der Tube mit 70% Ethanol.
- Assay-Beschichtung.
- Geben Sie 100 μl der Reporterzellsuspension mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung
.
- Geben Sie 100 μl Proben in dreifacher Ausfertigung in geeignete Assay-Wells.
- Die Platte für 22-24 h in einen 37 °C großen, befeuchteten 5 % CO2 -Inkubator umfüllen.
- Tauen Sie das Detektionssubstrat und den Detektionspuffer über Nacht in einem dunklen Kühlschrank auf, um sich auf Tag 2 vorzubereiten.
- Nehmen Sie kurz vor dem Ende der Platteninkubation das Detektionssubstrat und den Detektionspuffer aus dem Kühlschrank und stellen Sie es an einen lichtschwachen Ort, bis es zu RT äquilibriert ist. Sobald Sie bei RT sind, drehen Sie jedes Röhrchen mehrmals vorsichtig um, um die Lösungen gründlich zu mischen.
- Unmittelbar vor Abschluss der Inkubation gießen Sie den gesamten Inhalt des Detektionspuffers in das Röhrchen mit dem Detektionssubstrat, um das Luciferase-Detektionsreagenz herzustellen. Vorsichtig mischen, um keinen Schaum zu erzeugen.
- Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, drehen Sie die Platte um, um den Inhalt in einen geeigneten Abfallbehälter zu werfen. Klopfen Sie die Platte vorsichtig auf ein sauberes, saugfähiges Papiertuch, um die letzten Tröpfchen aus den Vertiefungen zu entfernen.
- Geben Sie 100 μl des Luciferase-Nachweisreagenzes in jede Vertiefung. Lassen Sie die Assay-Platte 15 Minuten lang bei RT ruhen. Schütteln Sie den Teller nicht.
- Quantifizieren Sie die Lumineszenz mit einem 96-Well-Platten-Lunometer.
