1. Zellkultur
- Bewahren Sie die Zellen in einem befeuchteten 37 °C/5 % CO2 -Inkubator auf und kulturieren Sie entweder mit DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (HeLa- und A431-Zellen) oder RPMI, ergänzt mit 15 % FBS (U266B1-Zellen). Kultivieren Sie die Zellen, bis sie eine Konfluenz von 70-80 % erreichen, trypsinisieren Sie sie und durchlaufen Sie sie oder verwenden Sie sie für die Assays.
Anmerkung: Nährmedien enthielten Phenolrot. Vor der Durchführung der Assays wurde für keine Zelllinie eine Serumaushungerung durchgeführt.
2. Titration von Stimulatoren oder Inhibitoren unter Verwendung des Zwei-Platten-Assay-Protokolls mit adhärenten Zellen
HINWEIS: Dieses Verfahren beschreibt, wie die Potenzen von Stimulatoren oder Inhibitoren bestimmt werden, indem eine Konzentrations-Wirkungs-Kurve aus einer Verdünnungsreihe der Testverbindung erzeugt wird.
- Aussaat von Zellen
- Dispensieren Sie 50 μl Zellen mit der voroptimierten Dichte (40.000 HeLa-Zellen/Well für STAT3 und STAT6; 75.000 A431-Zellen/Well für STAT5) in eine 96-Well-Platte, die mit Gewebekulturen behandelt wurde, in das entsprechende Kulturmedium. Über Nacht bei 37 °C/5 % CO2,
inkubieren
Anmerkung: Die optimale Zelldichte und die Inkubationszeit der Kultur müssen bestimmt werden.
- Verdünnungen von Prüfstoffen
- Bereiten Sie eine 2-fache Verdünnungsreihe der Testmasse(n) vor, indem Sie die Verbindung(en) seriell verdünnen (Verdünnungen im Halblog-Intervall) über 12 Vertiefungen einer Polypropylen-96-Well-Platte in das serumfreie Medium.
Anmerkung: Es wird empfohlen, eine Konzentrations-Wirkungs-Kurve mit einem halben Log-Intervall von 12 Punkten in mindestens Duplikaten durchzuführen, um eine genaue Schätzung des EC50 oder IC50 zu ermöglichen.
- Alternativ können Sie für hydrophobe, Dimethylsulfoxid (DMSO)-lösliche Testverbindungen die ersten Verdünnungen in 100 % DMSO durchführen und dann die Verdünnungsreihe der Verbindung in ein serumfreies Medium verdünnen.
Anmerkung: Die Toleranz des Assays gegenüber DMSO muss vor der Durchführung einer Titration der Testsubstanz in einem DMSO-Vehikel festgestellt werden. Es ist wichtig, die gleichen Lösungsmittelkonzentrationen zwischen behandelten und unbehandelten Zellen zu halten. Darüber hinaus sollten bei der Prüfung von seriellen Verdünnungen von Verbindungen die Lösungsmittelkonzentrationen über die Verdünnungsreihe hinweg immer konstant bleiben.
- Zellbehandlung
- Für die Zellstimulation fügen Sie 50 μl serumfreies Medium allein (unbehandelte Zellen) oder mit dem Stimulator (2x) hinzu.
- Inkubieren Sie für die voroptimierte Zeit entweder bei Raumtemperatur (RT) oder 37 °C (Interferon (IFN) α2b/20 min bei RT für STAT3; epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)/10 min bei RT für STAT5; Interleukin (IL)-4/20 min bei RT für STAT6). Fahren Sie dann mit Abschnitt 2.4.
fort.
Anmerkung: Die optimale Inkubationstemperatur muss bestimmt werden.
- Zur Zellhemmung fügen Sie 25 μl serumfreies Medium allein (unbehandelte Zellen) oder mit dem Inhibitor (4x) hinzu.
- Inkubieren Sie für die voroptimierte Zeit entweder bei RT oder 37 °C (JAK-Inhibitor 1/30 min bei RT für STAT3 und STAT6; Erlotinib/15 min bei RT für STAT5).
- 25 μl serumfreies Medium allein (unbehandelte Zellen) oder mit dem Stimulator (4x) beiEC-Wert 80 zugeben.
- Inkubieren Sie für die voroptimierte Zeit entweder bei RT oder 37 °C (gleiche Bedingungen wie in Schritt 2.3.2).
- Zelllyse
- Bereiten Sie den spezifischen 1x Supplementierten Lysepuffer des Kits vor, wie vom Hersteller angegeben.
Anmerkung: Es ist zwingend erforderlich, den 1x Lysepuffer mit dem 100x Phosphatase Inhibitor Cocktail zu ergänzen, der auf eine Endkonzentration von 1x verdünnt ist. Der 1x supplementierte Lysepuffer enthält 1 mM Natriumfluorid, 2 mM Natriumorthovanadat und 2 mM Beta-Glycerophosphat. Andere Phosphatasehemmer sind nicht erforderlich und sollten vermieden werden. Andere als die im Kit enthaltenen Lysepuffer und Phosphatasehemmer werden nicht empfohlen, da sie Inhaltsstoffe enthalten können, die die Messung beeinträchtigen könnten.
- Entfernen und entsorgen Sie das Zellkulturmedium vorsichtig, indem Sie den Überstand aspirieren.
- Sofort 50 μl 1x supplementierter Lysepuffer zugeben.
Anmerkung: Das Volumen des Lysepuffers (25-50 μL) kann optimiert werden.
- 30 min bei RT unter Schütteln inkubieren (orbitaler Plattenschüttler auf 400 U/min eingestellt; mäßiges Rühren).
Anmerkung: Die Inkubationszeit der Lyse (30-60 min) kann optimiert werden. Lysate können sofort für den Nachweis von Zielproteinen verwendet oder bei -80 °C eingefroren werden.
- TR-FRET-Detektion
- Bereiten Sie die 4x Antikörper-Nachweismischung in 1x Nachweispuffer vor, wie vom Hersteller angegeben.
- In diesem Übertragungsschritt pipettieren Sie vorsichtig 15 μl Zelllysat von der 96-Well-Kulturplatte in eine Vertiefung einer weißen 384-Well-Mikroplatte mit geringem Volumen.
- Geben Sie 15 μl des Positivkontrolllysats und 15 μl 1x Lysepuffer (Negativkontrolle) in getrennte Assay-Wells.
- Geben Sie 5 μl 4x Antikörper-Nachweismischung (entweder Eu-Ab1/FR-Ab2 zum Nachweis des Phosphoproteins oder Eu-Ab3/FR-Ab4 zum Nachweis des Gesamtproteins) in jede der Assay-Vertiefungen.
- Decken Sie die Platte mit einem Plattenversiegeler ab und inkubieren Sie sie je nach Assay 1 h bis über Nacht bei RT (siehe entsprechendes technisches Datenblatt).
Anmerkung: Die optimale Lesezeit muss für jeden Assay und jede Zelllinie optimiert werden. Die Platte kann mehrmals abgelesen werden, ohne dass sich dies negativ auf die Assay-Leistung auswirkt.
- Entfernen Sie das Klebeplatten-Versiegelungsmittel und lesen Sie die Platte auf einem TR-FRET-kompatiblen Mikroplatten-Reader ab.
Anmerkung: Filterbasierte Fluorometer werden empfohlen, obwohl einige Monochromatoren verwendet werden können. Vergewissern Sie sich, dass das entsprechende Optikmodul (Filter und Spiegel) für TR-FRET installiert ist. Verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von 320 oder 340 nm, um das Europium-Chelat anzuregen. Lesen Sie Assays sowohl bei 615 nm (oder 620 nm) als auch bei 665 nm, um sowohl die Emission des Donor-Europiums als auch des Akzeptorfluorophors zu detektieren. Die Geräteeinstellungen hängen vom jeweiligen Lesegerät ab. Die hier vorgestellten Daten wurden mit lampenbasierter Anregung, 90 μs Verzögerung, 300 μs Integrationszeit und 100 Blitzen pro Vertiefung gewonnen. Der Phospho-STAT4-Assay wurde jedoch mittels Laseranregung abgelesen, um höhere Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisse (S/B) zu erzeugen.
