Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft
1. Isolierung und Kultivierung menschlicher neuraler Vorläuferzellen (hNPCs)
- Legen Sie das Hirngewebe in eine 100 mm Petrischale und entfernen Sie vorsichtig die Hirnhäute mit einer Pinzette.
- Übertragen Sie das Hirngewebe in ein konisches 50-ml-Röhrchen und waschen Sie es zweimal mit 20 mL PBS, indem Sie das Röhrchen vorsichtig umdrehen.
- Inkubieren Sie das Hirngewebe in einem neuen konischen 50-ml-Röhrchen, indem Sie das Gewebe 10 Minuten lang bei 37 °C in Zelldissoziationslösung (siehe Materialtabelle) und DNase I (10 U/ml) tauchen.
- Geben Sie 5 ml neuronales Zellkulturmedium (siehe Materialtabelle) in das Röhrchen, das das Gehirngewebe enthält, und dissoziieren Sie die Neurosphären mechanisch, indem Sie 20 bis 30 Mal durch eine 1000-μl-Pipettenspitze reiben, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.
- Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 70 μm Zellsieb, um Zellcluster zu entfernen.
- Die Einzelzellsuspension wird in einem belüfteten T-25-Kolben mit 5-10 ml neuronalem Zellkulturmedium besiedelt, das mit den in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten ergänzt wird.
- Sterilisieren Sie die Heparinlösung durch Filtration durch einen 0,2 μm Filter. Das B-27-Supplement ohne Vitamin A ist ein serumfreies Supplement für die Kultivierung von neuralen Vorläuferzellen und Stammzellen, ohne eine Differenzierung zu induzieren.
Anmerkung: Humane neurale Vorläuferzellen (hNPCs) werden aus einem menschlichen fötalen Gehirn isoliert, das von einem abgetriebenen Fötus entnommen wurde. Nach 7–10 Tagen in Kultur bilden neurale Stammzellen (NSCs) frei schwebende Neurosphärenkolonien, während andere Zelltypen als Einzelzellen in Suspension bleiben oder sich am Boden des Kolbens anheften. Die isolierten hNPCs können als Neurosphären in Suspension für mehrere Monate kultiviert werden.
2. Die hNPCs passieren
- Sammeln Sie das Medium mit den schwebenden Kugeln, großen und kleinen Neurosphären, und überführen Sie sie in ein konisches 50-ml-Röhrchen.
Anmerkung: Aus unbekannten Gründen ist der Zeitpunkt für die Teilung der Neurosphären variabel von 7 Tagen bis zu 30 Tagen. Im Allgemeinen müssen Neurosphären jedoch durchgelassen werden, wenn sie einen Durchmesser von mehr als 700-900 μm erreichen. Dies ist der Zeitpunkt, an dem sich das Zentrum der Neurosphäre zu verdunkeln beginnt, was als Zeichen für eine hohe Zelltodrate angesehen wird.
- Schleudern Sie die Neurosphären durch Zentrifugation bei 300-400 x g für 3 min.
- Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und tauchen Sie die Kugeln dann in 500 μl aufgetautes Zelldissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie Aliquote des Zelldissoziationsreagenzes her, indem Sie 500 μl pro 1,5 ml-Mikroröhrchen hinzufügen und bei -20 °C lagern. Um einen Verlust der Enzymaktivität zu vermeiden, tauen Sie das Zelldissoziationsreagenz auf, indem Sie es auf RT halten oder 5 Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasser-/Bead-Bad erwärmen
.
- Je nach Dichte und Größe der Kugeln die getauchten Kugeln bei 37 °C für 5-15 min inkubieren.
- Geben Sie 5-10 ml vorgewärmtes Nährmedium zu den Neurosphären mit 50 ml konischem Röhrchen und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 300-400 x g, um die Neurosphären zu sedimentieren.
- Aspirieren Sie den Überstand und pipettieren Sie ihn vorsichtig mit einer 1000-μl-Pipette in 2 ml Nährmedium auf und ab, bis sich alle Neurosphären in einer Einzelzellsuspension befinden.
Anmerkung: Die Dissoziation wird mit bloßem Auge sichtbar. Vor der Dissoziation liegen die Neurosphären in Form von Kugeln vor. Nach dem Eintauchen in das Dissoziationsreagenz und durch Auf- und Abpipettieren werden sie zu einzelnen Zellen.
- Zählen und dispontieren Sie die einzelnen Zellen, 2 bis 3 Millionen Zellen pro T-25-Kolben, in 10 ml Kulturmedium.
- Füttern Sie die Zellen alle 3 Tage, indem Sie die Hälfte des Nährmediums austauschen.
- Beruhigen Sie die Neurosphären, indem Sie den Kolben so anlehnen, dass er sich in der unteren Ecke befindet. Halten Sie den Kolben ca. 1-2 Minuten in dieser Position, bis sich die Neurosphären sedimentieren. Aspirieren Sie dann vorsichtig die Hälfte des Mediums, indem Sie die serologische Pipette in das Medium oberhalb der abgesetzten Neurosphären einführen. Dissoziierte Zellen können sich nach 2 bis 3 Tagen in Kultur zu Kugeln zusammenschließen.
3. Einfrieren der hNPCs
- Bereiten Sie das Zellgefriermedium vor, indem Sie dem Kulturmedium DMSO bis zu einer Endkonzentration von 10 % (v/v) zusetzen, oder verwenden Sie ein kommerziell erhältliches Kryokonservierungsmedium für empfindliche Zelltypen (siehe Materialtabelle).
- Sortieren Sie große Kugeln, indem Sie das Medium in ein konisches 50-ml-Röhrchen geben und die Kugeln durch die Schwerkraft absetzen lassen. Nehmen Sie dann die großen Neurosphären heraus und überführen Sie sie in ein neues konisches 50-ml-Röhrchen zur Passage mit einer 200- oder 1000-μl-Pipettenspitze.
Anmerkung: Neurosphären mit einem Durchmesser von mehr als 900 μm gelten als groß und solche mit einem Durchmesser von weniger als 500 μm als klein.
- Die restlichen Neurosphären durch Zentrifugation bei 300-400 x g für 3 min abschleudern. Den Überstand vorsichtig entfernen.
- Resuspendieren Sie bis zu 100 Kugeln in 1 ml Kryokonservierungsreagenz und übertragen Sie es in ein Kryoröhrchen.
- Über Nacht bei -80 °C in einem Gefrierbehälter lagern (siehe Materialtabelle) und am nächsten Tag zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff umfüllen.
Anmerkung: Es ist vorzuziehen, kleine bis mittelgroße Neurosphären (mit einem Durchmesser von weniger als 900 μm) einzufrieren und das Einfrieren von großen Neurosphären (mit einem Durchmesser von mehr als 900 μm) oder einzelnen Zellen zu vermeiden. Um Zellschäden beim Auftauen der Probe zu reduzieren, halten Sie die Zellen dicht, indem Sie die aufgetauten Neurosphären in einen kleinen T25-Kolben aussäen.
4. Bewertung der Neurotoxizität
HINWEIS: Die Zytotoxizität von Testverbindungen wird in 384-Well-Platten (siehe Materialtabelle) unter Verwendung eines Viabilitätsassays für lumineszierende Zellen (siehe Materialtabelle) bewertet. Die hNPCs werden nach der gleichen Methode hergestellt, mit Ausnahme geringfügiger Modifikationen, die im Abschnitt "Differenzierung und Behandlung von hNPCs" beschrieben sind. Anschließend wird ein Lumineszenzsignal, das durch einen Lumineszenzzellviabilitätsassay erzeugt wird, mit einem Mikroplatten-Reader gemessen. Das Lumineszenzsignal ist proportional zur zellulären ATP-Konzentration, die wiederum direkt proportional zur Anzahl der in jeder Vertiefung vorhandenen lebensfähigen Zellen ist.
- Beschichtung
- Fügen Sie 30 μl Poly-L-Lysin (PLL) pro Vertiefung einer 384-Well-Platte hinzu.
- 1 h bei RT inkubieren.
- 2x mit PBS waschen.
- Bei RT trocknen lassen (ca. 30 min).
- Fügen Sie 30 μl Laminin (50 μg/ml) pro Vertiefung einer 384-Well-Platte hinzu.
- 2 h bei 37 °C inkubieren.
- 2x mit PBS.
waschen
Anmerkung: Beschichtete 384-Well-Platten können 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden.
- Plattieren der Zellen
- Zählen und plattieren Sie 20.000 einzellige Neurosphären pro Well einer 384-Well-Platte in 25 μl Differenzierungsmedium.
- 5 Tage bei 37 °C inkubieren.
- Nach 5 Tagen werden die Zellen 24 Stunden lang mit Testverbindungen behandelt, die mit dem 6-fachen der gewünschten Endkonzentration in 5 μl Volumen hergestellt wurden (um das endgültige Volumen von 30 μl pro Vertiefung zu erreichen).
- Assay zur Zellviabilität
- Geben Sie 30 μl Reagenz für den Lumineszenz-Zellviabilitätsassay pro Vertiefung einer 384-Well-Platte hinzu.
Anmerkung: Fügen Sie ein Volumen des Reagenzes für den Lumineszenz-Zellviabilitätsassay hinzu, das dem in jeder Vertiefung vorhandenen Volumen entspricht. Tauen Sie das Reagenz des Lumineszenzzell-Viabilitätsassays auf und äquilibrieren Sie es vor der Verwendung auf RT.
- Auf einem Plattenschüttler 2 Minuten lang schütteln (zum Mischen und Induzieren der Zelllyse).
- Schleudern Sie die Mischung durch Zentrifugieren bei 300-400 x g für 30 s herunter.
- Inkubieren Sie die 384-Well-Platte 10 Minuten lang bei RT an einem lichtgeschützten Ort (zur Stabilisierung des Lumineszenzsignals).
- Erfassen Sie die Lumineszenz mit einem Mikroplatten-Reader.
Anmerkung: Für den Viabilitätstest sind geeignete Kontrollen zu verwenden, einschließlich Velcade (bei einer Endkonzentration von 10 μM) als positiv und HBSS-haltiges DMSO (mit einer Endkonzentration von 0,1 % bzw. 0,2 %) als Negativkontrolle.
Tabelle 1. Erforderliche Komponenten für die Herstellung von 100 ml Nährmedien
| Menge | Bestandteil |
| 100 μL | EGF (20 ng/ml) |
| 100 μL | FGF (10 ng/ml) |
| 2 mL | B-27, minus Vitamin A (50X) |
| 1 mL | L-Alanyl-L-Glutamin (100X) (siehe Materialtabelle) |
| 4 μL | Heparin (2 μg/ml) |
| 96,8 mL | Neuronales Zellkulturmedium (siehe Materialtabelle) |
