Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>18 mm kreisförmige Deckgläser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Vor Gebrauch sterilisieren</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Aufgelöst in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>Artikel-Nr.: 12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoreszenz-Eindeckmedium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyd</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Nr. P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Siehe Referenzen 8 und 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-Tabletten</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysin-Hydrobromid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Nr. 7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Nr. S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunfluoreszenz-assay zur bewertung der wirkung von zielproteinen auf das neuritenwachstum

Quelle: Chan, W., W., R. et al. <a href="https://app.jove.com/v/60031">Ein verbesserter Assay auf Basis von Grünfluoreszenzproteinen zur Untersuchung des Neuritenwachstums in primären Neuronen.</a> J. Vis. Exp. (2019).
In diesem Video demonstrieren wir einen EGFP-basierten Immunfluoreszenz-Assay, um die Wirksamkeit von Zielproteinen auf das Neuritenwachstum primärer kortikaler Neuronen zu identifizieren. Die primären Neuronen werden mit einem fluoreszierenden Protein, EGFP, und einem Zielprotein transfiziert, und dann wird ein Immunoassay durchgeführt, um die Wirkung des Zielproteins auf das Neuritenwachstum zu untersuchen.

Immunfluoreszenz-Assay zur Bewertung der Wirkung von Zielproteinen auf das Neuritenwachstum

Quelle: Chan, W., W., R. et al. Ein verbesserter Assay auf Basis von Grünfluoreszenzproteinen zur Untersuchung des Neuritenwachstums in primären Neuronen. J. Vis. Exp. 
...

Sich entwickelnde Neuronen verlängern zytoplasmatische Prozesse aus ihren Zellkörpern durch das Auswachsen von Neuriten, um Dendriten und Axone zu entwickeln, die für die Kommunikation von Neuron zu Neuron unerlässlich sind.
Um die Wirkung eines Zielproteins auf das Wachstum von Neuriten zu untersuchen, nehmen Sie eine Multiwell-Platte mit einem Poly-D-Lysin-beschichteten Deckglas an der Basis. Auf der Oberfläche des Deckglases befindet sich eine adhärente Kultur von primären kortikalen Neuronen, die aus dem embryonalen Rattengehirn stammen.
Behandeln Sie die Neuronen mit einer Mischung, die zwei Arten von Plasmiden enthält – ein EGFP-Plasmid, das für ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein kodiert, und ein zweites Plasmid, das für das Zielprotein in einem geeigneten Transfektionsreagenz kodiert.
Das Transfektionsreagenz erleichtert den Eintritt der Plasmide in die Zellen.
Nach der Transfektion werden beide Plasmide exprimiert, wodurch grün fluoreszierende Proteine und Zielproteine entstehen. Die Expression von EGFP verleiht den co-transfizierten Zellen grüne Fluoreszenz.
Zielproteine mit Neuritenauswuchs-stimulierendem Potenzial initiieren die zelluläre Signalübertragung, die die Reorganisation des Zytoskeletts fördert und zur Entwicklung neuronaler Projektionen und deren Erweiterungen führt.
Aspirieren Sie das verbrauchte Medium und fixieren Sie die Zellen mit Paraformaldehyd. Gegenfärbung der Zellen mit rot fluoreszenzmarkierten Anti-Zielprotein-Antikörpern, die spezifisch exprimierte Zielproteine binden und den Zellen zusätzliche rote Fluoreszenz verleihen.
Entfernen Sie das Deckglas von der Kulturplatte und betrachten Sie es unter einem Fluoreszenzmikroskop.
Co-transfizierte Zellen, die ein zweifarbiges Fluoreszenzsignal aufweisen, zeigen längere neuronale Prozesse als Zellen ohne rote Fluoreszenz, was die stimulierende Wirkung des Zielproteins auf das Wachstum von Neuriten bestätigt.

Nach zwei Tagen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid verdünnen Sie EGFP und die Plasmid-DNA des Zielproteins sowie das Transfektionsreagenz in zwei separaten 1,5-Milliliter-Röhrchen und mischen Sie sie dann miteinander. Transfizieren Sie die Zellen mit EGFP-Konstrukt, indem Sie die Transfektionsmischung in die Vertiefungen geben.
Waschen Sie die Zellen nach 24 Stunden mit 37 Grad Celsius PBS und fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.
Waschen Sie die fixierten Zellen am Ende der Inkubation dreimal mit frischem PBS pro Waschgang und geben Sie ein minimales Volumen an Fluoreszenzeindeckmedium auf einen Objektträger pro Probe. Übertragen Sie dann die beschichteten Deckgläser vorsichtig auf das Eindeckmedium, wobei die Proben zu den Objektträgern zeigen.
Um das Neuritenwachstum abzubilden, wählen Sie das 40x-Objektiv an einem Epifluoreszenzmikroskop aus und klicken Sie auf "Start", um Bilder von mindestens 40 intakten EGFP-positiven Neuronen pro Transfektion aufzunehmen.
Wenn alle neuen Rechte abgebildet wurden, öffnen Sie die aufgenommenen Bilder in ImageJ mit dem NeuronJ-Plugin und messen Sie die Länge des längsten Neuriten jedes Neurons vom Zellkörper bis zur Spitze des Wachstumskegels. Analysieren Sie dann die mit der Software erhaltenen Daten, um die Wirkung der Zielproteine auf das Neuritenwachstum zu bestimmen.

immunofluorescence-assay-to-evaluate-effect-target-proteins-on

Research

Forschung

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Biologische Techniken

Assay Techniques

Assay-Techniken

Immunoassays

Immunofluorescence Assay to Evaluate Effect of Target Proteins on Neurite Outgrowth

993 Aufrufe. Sich entwickelnde Neuronen verlängern zytoplasmatische Prozesse aus ihren Zellkörpern durch das Auswachsen von Neuriten, um Dendriten und Axone zu entwickeln, die für die Kommunikation von Neuron zu Neuron unerlässlich sind. Um die Wirkung eines Zielproteins auf das Wachstum von Neuriten zu untersuchen, nehmen Sie eine Multiwell-Platte mit einem Poly-D-Lysin-beschichteten Deckglas an der Basis. Auf der Oberfläche des Deckglases befindet sich eine adhärente Kultur von primären ko...

Immunfluoreszenz-Assay zur Bewertung der Wirkung von Zielproteinen auf das Neuritenwachstum

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Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
18 mm kreisförmige Deckgläser	Thermo Scientific	CB00180RA	Vor Gebrauch sterilisieren
Cytochalasin D	Invitrogen	PHZ1063	Aufgelöst in DMSO
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	Artikel-Nr.: 12362
Fluoreszenz-Eindeckmedium	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz	Invitrogen	11668019
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	Nr. P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Siehe Referenzen 8 und 15
PBS-Tabletten	Gibco	18912014
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-D-Lysin-Hydrobromid	Sigma-Aldrich	Nr. 7280
Spatel	Sigma-Aldrich	Nr. S4147
Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot	Gibco	25300062