Split-Luciferase-Komplementationsassay zur Identifizierung spezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen

Abstract

Quelle: Wiertelak, W. et.al., Demonstration heterologer Komplexe, die von Golgi-residenten Typ-III-Membranproteinen gebildet werden, unter Verwendung des Split-Luciferase-Komplementationsassays. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt den Split-Luciferase-Komplementationsassay zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen. In diesem Assay werden die Proteine von Interesse an kleine und große Fragmente des Luciferase-Enzyms getaggt. Wenn die Proteine interagieren, verbinden sich die großen und kleinen Fragmente zu einem aktiven Enzymkomplex, der in Gegenwart eines bestimmten Substrats eine helle Lumineszenz freisetzt, die gemessen werden kann.

Protocol

1. Transiente Transfektion der Expressionsplasmide in die Zellen

1. Ernten Sie das adhärente HEK293T der Zellkultur durch Trypsinisierung und resuspendieren Sie die Zellen in einem speziellen vollständigen Wachstumsmedium. Plattieren Sie die Zellen (2 x 10⁴/100 μl/Well) auf eine 96-Well-Platte mit klarem Boden und weißer Seite. Passen Sie die Gesamtzahl der Wells an, um alle getesteten Kombinationen und Kontrollen einschließlich Replikationen aufzunehmen.
   Anmerkung: Versuchen Sie, nur die inneren 60 Vertiefungen der Platte zu verwenden, um thermische Verschiebungen zu minimieren und eine Verdunstung über Nacht zu vermeiden. Die Verwendung von Poly-D-Lysin-beschichteten Platten, wie sie in der Materialtabelle angegeben sind, wird dringend empfohlen, da sich sonst die Zellen bei den nachfolgenden Waschschritten ablösen können.
2. Die Zellen werden über Nacht unter Standardbedingungen (37 °C, 5 % CO₂) kultiviert.
3. Am nächsten Tag transfizieren Sie die Zellen mit den gewünschten Kombinationen von Expressionsplasmiden.
   1. Verdünnen Sie die Expressionsplasmide in einem serumfreien Medium (siehe Materialtabelle) auf 6,25 ng/μl für jedes Konstrukt.
   2. Das Transfektionsreagenz auf Lipidbasis in einem geeigneten Lipid-DNA-Verhältnis zugeben und gemäß den Anweisungen des Herstellers inkubieren.
   3. 8 μl Lipid: DNA-Gemisch in die dafür vorgesehenen Vertiefungen geben. Mischen Sie den Inhalt der Platte durch sanftes Drehen. Dies führt zur Transfektion beider Expressionskonstrukte bei 50 ng/Well.
4. Die Zellen werden 20-24 h lang unter Standardbedingungen (37 °C, 5 % CO₂) kultiviert.
   Anmerkung: Eine längere Kultivierung der Zellen kann zu einer höheren Expression des Fusionsproteins führen, was eine unspezifische Assoziation zwischen den Fragmenten fördern kann.

2. Mittlerer Austausch

1. Ersetzen Sie am nächsten Tag das konditionierte Medium durch 100 μl eines serumfreien Mediums in jeder Vertiefung. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellen beim Medienaustausch nicht abgelöst haben.
   Anmerkung: Dieser Schritt sollte 2-3 h vor der Zugabe der Furimazin-Arbeitslösung durchgeführt werden. Der Serumentzug minimiert den Hintergrund, der durch die Autolumineszenz von Furiamazin verursacht wird.

3. Herstellung der Furimazin-Arbeitslösung

1. Mischen Sie kurz vor der Messung 1 Volumen Furimazin mit 19 Volumen eines Verdünnungspuffers (eine 20-fache Verdünnung).
   Anmerkung: Das Gesamtvolumen der herzustellenden Furimazin-Arbeitslösung hängt von der Anzahl der einzelnen Wells ab, die analysiert werden sollen (die Furimazin-Arbeitslösung wird im Verhältnis 1:5 zum Zellkulturmedium gegeben, daher sollten zu jeder Vertiefung, die zuvor mit 100 μl eines serumfreien Mediums gefüllt wurde, 25 μl der Furimazin-Arbeitslösung zugegeben werden).
2. Geben Sie die Furimazin-Arbeitslösung in die dafür vorgesehenen Vertiefungen (25 μl/Vertiefung). Mischen Sie die Platte vorsichtig von Hand oder mit einem Orbitalschüttler (z. B. 15 s bei 300-500 U/min).

4. Messung der Lumineszenz

1. Setzen Sie die Platte in einen Lumineszenz-Mikroplatten-Reader ein.
   1. Für Experimente, die bei 37 °C durchgeführt werden sollen, äquilibrieren Sie die Platte für 10-15 min bei der angegebenen Temperatur.
2. Wählen Sie die zu analysierenden Vertiefungen aus.
3. Lesen Sie die Lumineszenz mit einer Integrationszeit von 0,3 s. Überwachen Sie die Lumineszenz bei Bedarf bis zu 2 Stunden lang.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% Trypsin-EDTA-Lösung			Zellkultur
Adhärente Säugetierzelllinie			Zellkultur
BioCoat Poly-D-Lysin 96-Well, weiß/klar, TC-behandelte Mikroplatte mit flachem Boden, mit Deckel	Corning	356651	Kunststoff-Ware
Zellkultur-Zentrifuge			Kunststoff-Ware
Nahrungsergänzungsmittel für Zellkulturen (hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum, L-Glutamin, Penicillin, Streptomycin)			Zellkultur
CO2-Inkubator			Gerät
Expressionsplasmide, die für Proteine von Interesse kodieren, die nicht mit NanoBiT-Fragmenten markiert			Probe
FuGENE HD Transfektionsreagenz	Promega	Nr. E2311	Probe
GloMax Discover Microplate Reader (oder ein anderer Lumineszenz-Mikroplatten-Reader)	Promega	GM3000	Gerät
Wachstumsmedium für die verwendete Zelllinie			Zellkultur
Materialien und Reagenzien für die molekulare Standardklonierung (Bakterien, thermostabile Polymerase, Restriktionsenzyme, DNA-Ligase, Materialien und Reagenzien für die Nukleinsäurereinigung)			Probe
NanoBiT MCS Startersystem	Promega	N2014	Dieses Kit enthält Vektoren, die die Markierung der interessierenden Proteine mit NanoBiT-Fragmenten in unterschiedlichen Orientierungen ermöglichen, sowie das Kontrollplasmid, das für das HaloTag-Protein kodiert, das mit SmBiT fusioniert ist, und ein positives Kontrollplasmidpaar.
Nano-Glo Lebendzell-Assay-System	Promega	Nr. 2011	Dieses Kit enthält Furimazin, ein Substrat, das den Nachweis der NanoLuc-Aktivität in lebenden Zellen ermöglicht, und einen speziellen Verdünnungspuffer.
Opti-MEM I Reduziertes Serummedium, kein Phenolrot	Gibco	11058021	Zellkultur
Orbital-Shaker			Gerät