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Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft
1. MeCP2-ECLIA-Protokoll
- Herstellung der Waschlösung, des Blockierungspuffers und der Verdünnungslösung (Tag 1)
- 500 μl Tween 20 bis 1 l PBS zugeben, um ein 0,05%iges Tween 20 in PBS-Lösung herzustellen, kräftig mischen und als "Waschlösung" kennzeichnen.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass nur frisch zubereiteter Waschpuffer verwendet wird.
- Bereiten Sie eine Blockierungslösung aus 3% Blocker A (Table of Materials) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. Unter leichtem Rühren mischen, filtrieren, sterilisieren und bis zur Verwendung maximal zwei Wochen im Kühlschrank aufbewahren.
- Fügen Sie 5 ml Blockierungslösung zu 10 ml PBS hinzu, um eine Assay-Verdünnungslösung herzustellen (1 % Blocker A in PBS).
- Beschichtung von High Bind Platten
- Nehmen Sie eine 96-Well-Multi-Array-Single-Spot-High-Bind-Platte heraus.
Anmerkung: High-Bind-Platten haben ein größeres Bindungsvermögen und damit einen größeren Dynamikbereich als Standardplatten mit hydrophoben Oberflächen.
- Tauen Sie den monoklonalen Maus-Anti-MeCP2-Antikörper auf Eis auf und mischen Sie 0,67 μl des Antikörpers mit 4 ml PBS (1:6.000 Antikörperverdünnung in PBS). Die Antikörperlösung vermischen sich gut und markieren das Röhrchen als "Beschichtungslösung".
- Geben Sie vorsichtig 25 μl Beschichtungslösung mit einer Mehrkanalpipette in die untere Ecke jeder Vertiefung; dies wird als Lösungsbeschichtungsmethode bezeichnet. Klopfen Sie auf jede Seite vorsichtig auf die 96-Well-Platte, um sicherzustellen, dass die Beschichtungslösung den Boden jeder Wells bedeckt.
- Verschließen Sie die Platte mit einer Klebefolie und inkubieren Sie die Platte über Nacht (12−16 h) bei 4 °C im Kühlschrank.
- Blockieren (Tag 2)
- Den Teller aus dem Kühlschrank nehmen und die Folie entfernen.
- Entfernen Sie die Antikörper-Beschichtungslösung, indem Sie sie in den Papierkorb schnippen, und klopfen Sie die Platte auf ein Papiertuch, um die gesamte Beschichtungslösung aus den Vertiefungen zu entfernen.
- Fügen Sie 125 μl Blockierungslösung pro Vertiefung hinzu. Verschließen Sie die Platte wieder und legen Sie sie auf einen orbitalen Mikrotiterplatten-Shaker.
- Inkubieren Sie die Platte 90 Minuten lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln bei 800 U/min.
- Erstellung von Standards und Mustern
- Bereiten Sie während der Inkubationszeit die MeCP2- und/oder TAT-MeCP2-Proteinstandards und verschiedene Proben vor.
Anmerkung: Der für die Standardverdünnung verwendete Lysepuffer muss mit dem in den analysierten Proben verwendeten Puffer identisch sein.
- Eine Durchstechflasche mit MePC2- und/oder TAT-MeCP2-Proteinstammlösung (250 μg/ml), Maushirnlysaten und HDF-Lysaten bei -80 °C herausnehmen. Auf Eis auftauen.
- Die Standard-Stammlösung (MeCP2 und/oder TAT-MeCP2) wird in sauberen Röhrchen gemäß Tabelle 1 verdünnt.
- Verdünnen Sie die Proben in Lysepuffer wie folgt: 1-20 μg Maushirnlysat pro 25 μl Lysepuffer und 0,25-1 μg HDF-Lysat pro 25 μl Lysepuffer. Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen jeder Probe vor, um die Analyse in dreifacher Ausfertigung durchzuführen.
- Hinzufügen der Proben und Standardlösungen
- Entfernen Sie die Verstopfungslösung, indem Sie sie in den Papierkorb schnippen, und klopfen Sie die Platte auf ein Papiertuch, um die gesamte Verstopfungslösung aus den Vertiefungen zu entfernen.
- Waschen Sie die Platte 3x mit 150 μl Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.
- Geben Sie 25 μl Standards und Proben mit einer Einkanalpipette in die untere Ecke der Vertiefung.
- Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie die Platte 4 h lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln bei 800 U/min.
- Unmarkierter Nachweis-Antikörper
- Tauen Sie den polyklonalen Kaninchen-Anti-MeCP2-Antikörper auf Eis auf. Verdünnen Sie den Antikörper im Verhältnis 1:6.000 in einer Verdünnungslösung.
- Entnehmen Sie die Standards und Proben, indem Sie sie in den Papierkorb schnippen, und klopfen Sie die Platte auf ein Papiertuch.
- Waschen Sie die Platte 3x mit 150 μl Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.
- Geben Sie mit der Mehrkanalpipette 25 μl unmarkierten Nachweisantikörper in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie 1 h lang unter ständigem Schütteln bei 800 U/min bei Raumtemperatur.
- Spezifischer konjugierter Antikörper
- Nehmen Sie den spezifischen Sekundärantikörper (Table of Materials) aus dem Kühlschrank und legen Sie ihn auf Eis. Der Antikörper 1:666,67 wird in einer Verdünnungslösung verdünnt und vorsichtig gemischt.
- Entfernen Sie den freien, unmarkierten Sekundärantikörper, indem Sie ihn in den Papierkorb schnippen, und klopfen Sie die Platte auf ein Papiertuch.
- Waschen Sie die Platte 3x mit 150 μl Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.
- Geben Sie mit der Mehrkanalpipette 25 μl spezifischen konjugierten Antikörper (Materialtabelle) in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie 1 h lang unter ständigem Schütteln bei 800 U/min bei Raumtemperatur.
- Ablesen der Platte
- Entfernen Sie den freien konjugierten Antikörper (Table of Materials), indem Sie ihn in den Papierkorb schnippen und auf die Platte auf ein Papiertuch klopfen.
- Waschen Sie die Platte 3x mit 150 μl Waschlösung.
- Geben Sie 150 μl 1x Tris-basierten Gold-Lesepuffer (Tabelle der Materialien) mit einem Tensid, das Tripropylamin als Co-Reaktant zur Lichterzeugung enthält, auf die Platte. Vermeiden Sie Luftblasen, indem Sie umgekehrte Pipettiertechniken anwenden.
- Legen Sie die Platte auf die Mikroplatten-Detektionsplattform (Table of Materials) und starten Sie sofort die Messung. Verwenden Sie die Einstellungen für die Erfassung von 96-Well-Platten.
- Erfassung der Elektrochemilumineszenzsignale durch eine eingebaute CCD-Kamera in einem Elektrochemilumineszenz-Detektionssystem (Table of Materials) und Aufzeichnung der Signalzählungen, die den relativen Lichteinheiten (RLU) entsprechen und direkt proportional zur Lichtintensität sind.
Anmerkung: Bei elektrochemischer Stimulation emittiert die an die Kohlenstoffelektrode gebundene Rutheniummarkierung Lumineszenzlicht bei 620 nm. Analysieren Sie die Daten mit der gerätebegleitenden Software (Table of Materials).
Tabelle 1: Standardreihen von 0 bis 1.800 ng/ml.
| Norm | Konzentration | Verdünnung |
| Norm 1 | 1.800 ng/ml | 1,08 μl Standard-Stammlösung + 148,92 μl Lysepuffer |
| Norm 2 | 600 ng/ml | 50 μL Standard 1 + 100 μl Lysepuffer |
| Norm 3 | 200 ng/ml | 50 μL Standard 2 + 100 μL Lysepuffer |
| Norm 4 | 66,67 ng/ml | 50 μl Standard 3 + 100 μl Lysepuffer |
| Norm 5 | 22,22 ng/ml | 50 μL Standard 4 + 100 μL Lysepuffer |
| Norm 6 | 7,41 ng/ml | 50 μL Standard 5 + 100 μl Lysepuffer |
| Norm 7 | 2,47 ng/ml | 50 μL Standard 6 + 100 μl Lysepuffer |
| Norm 8 | 0,82 ng/ml | 50 μL Standard 7 + 100 μl Lysepuffer |
| Norm 9 | 0,27 ng/ml | 50 μL Standard 8 + 100 μL Lysepuffer |
| Norm 10 | 0 ng/ml | 150 μl Lysepuffer |