Elektrochemilumineszenz-Assay zur Quantifizierung der Zielproteinspiegel im Gehirnlysat

Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft

1. MeCP2-ECLIA-Protokoll

1. Herstellung der Waschlösung, des Blockierungspuffers und der Verdünnungslösung (Tag 1)
   1. 500 μl Tween 20 bis 1 l PBS zugeben, um ein 0,05%iges Tween 20 in PBS-Lösung herzustellen, kräftig mischen und als "Waschlösung" kennzeichnen.
      Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass nur frisch zubereiteter Waschpuffer verwendet wird.
   2. Bereiten Sie eine Blockierungslösung aus 3% Blocker A (Table of Materials) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. Unter leichtem Rühren mischen, filtrieren, sterilisieren und bis zur Verwendung maximal zwei Wochen im Kühlschrank aufbewahren.
   3. Fügen Sie 5 ml Blockierungslösung zu 10 ml PBS hinzu, um eine Assay-Verdünnungslösung herzustellen (1 % Blocker A in PBS).
2. Beschichtung von High Bind Platten
   1. Nehmen Sie eine 96-Well-Multi-Array-Single-Spot-High-Bind-Platte heraus.
      Anmerkung: High-Bind-Platten haben ein größeres Bindungsvermögen und damit einen größeren Dynamikbereich als Standardplatten mit hydrophoben Oberflächen.
   2. Tauen Sie den monoklonalen Maus-Anti-MeCP2-Antikörper auf Eis auf und mischen Sie 0,67 μl des Antikörpers mit 4 ml PBS (1:6.000 Antikörperverdünnung in PBS). Die Antikörperlösung vermischen sich gut und markieren das Röhrchen als "Beschichtungslösung".
   3. Geben Sie vorsichtig 25 μl Beschichtungslösung mit einer Mehrkanalpipette in die untere Ecke jeder Vertiefung; dies wird als Lösungsbeschichtungsmethode bezeichnet. Klopfen Sie auf jede Seite vorsichtig auf die 96-Well-Platte, um sicherzustellen, dass die Beschichtungslösung den Boden jeder Wells bedeckt.
   4. Verschließen Sie die Platte mit einer Klebefolie und inkubieren Sie die Platte über Nacht (12−16 h) bei 4 °C im Kühlschrank.
3. Blockieren (Tag 2)
   1. Den Teller aus dem Kühlschrank nehmen und die Folie entfernen.
   2. Entfernen Sie die Antikörper-Beschichtungslösung, indem Sie sie in den Papierkorb schnippen, und klopfen Sie die Platte auf ein Papiertuch, um die gesamte Beschichtungslösung aus den Vertiefungen zu entfernen.
   3. Fügen Sie 125 μl Blockierungslösung pro Vertiefung hinzu. Verschließen Sie die Platte wieder und legen Sie sie auf einen orbitalen Mikrotiterplatten-Shaker.
   4. Inkubieren Sie die Platte 90 Minuten lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln bei 800 U/min.
4. Erstellung von Standards und Mustern
   1. Bereiten Sie während der Inkubationszeit die MeCP2- und/oder TAT-MeCP2-Proteinstandards und verschiedene Proben vor.
      Anmerkung: Der für die Standardverdünnung verwendete Lysepuffer muss mit dem in den analysierten Proben verwendeten Puffer identisch sein.
   2. Eine Durchstechflasche mit MePC2- und/oder TAT-MeCP2-Proteinstammlösung (250 μg/ml), Maushirnlysaten und HDF-Lysaten bei -80 °C herausnehmen. Auf Eis auftauen.
   3. Die Standard-Stammlösung (MeCP2 und/oder TAT-MeCP2) wird in sauberen Röhrchen gemäß Tabelle 1 verdünnt.
   4. Verdünnen Sie die Proben in Lysepuffer wie folgt: 1-20 μg Maushirnlysat pro 25 μl Lysepuffer und 0,25-1 μg HDF-Lysat pro 25 μl Lysepuffer. Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen jeder Probe vor, um die Analyse in dreifacher Ausfertigung durchzuführen.
5. Hinzufügen der Proben und Standardlösungen
   1. Entfernen Sie die Verstopfungslösung, indem Sie sie in den Papierkorb schnippen, und klopfen Sie die Platte auf ein Papiertuch, um die gesamte Verstopfungslösung aus den Vertiefungen zu entfernen.
   2. Waschen Sie die Platte 3x mit 150 μl Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.
   3. Geben Sie 25 μl Standards und Proben mit einer Einkanalpipette in die untere Ecke der Vertiefung.
   4. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie die Platte 4 h lang bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln bei 800 U/min.
6. Unmarkierter Nachweis-Antikörper
   1. Tauen Sie den polyklonalen Kaninchen-Anti-MeCP2-Antikörper auf Eis auf. Verdünnen Sie den Antikörper im Verhältnis 1:6.000 in einer Verdünnungslösung.
   2. Entnehmen Sie die Standards und Proben, indem Sie sie in den Papierkorb schnippen, und klopfen Sie die Platte auf ein Papiertuch.
   3. Waschen Sie die Platte 3x mit 150 μl Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.
   4. Geben Sie mit der Mehrkanalpipette 25 μl unmarkierten Nachweisantikörper in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie 1 h lang unter ständigem Schütteln bei 800 U/min bei Raumtemperatur.
7. Spezifischer konjugierter Antikörper
   1. Nehmen Sie den spezifischen Sekundärantikörper (Table of Materials) aus dem Kühlschrank und legen Sie ihn auf Eis. Der Antikörper 1:666,67 wird in einer Verdünnungslösung verdünnt und vorsichtig gemischt.
   2. Entfernen Sie den freien, unmarkierten Sekundärantikörper, indem Sie ihn in den Papierkorb schnippen, und klopfen Sie die Platte auf ein Papiertuch.
   3. Waschen Sie die Platte 3x mit 150 μl Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen.
   4. Geben Sie mit der Mehrkanalpipette 25 μl spezifischen konjugierten Antikörper (Materialtabelle) in jede Vertiefung. Verschließen Sie die Platte und inkubieren Sie sie 1 h lang unter ständigem Schütteln bei 800 U/min bei Raumtemperatur.
8. Ablesen der Platte
   1. Entfernen Sie den freien konjugierten Antikörper (Table of Materials), indem Sie ihn in den Papierkorb schnippen und auf die Platte auf ein Papiertuch klopfen.
   2. Waschen Sie die Platte 3x mit 150 μl Waschlösung.
   3. Geben Sie 150 μl 1x Tris-basierten Gold-Lesepuffer (Tabelle der Materialien) mit einem Tensid, das Tripropylamin als Co-Reaktant zur Lichterzeugung enthält, auf die Platte. Vermeiden Sie Luftblasen, indem Sie umgekehrte Pipettiertechniken anwenden.
   4. Legen Sie die Platte auf die Mikroplatten-Detektionsplattform (Table of Materials) und starten Sie sofort die Messung. Verwenden Sie die Einstellungen für die Erfassung von 96-Well-Platten.
   5. Erfassung der Elektrochemilumineszenzsignale durch eine eingebaute CCD-Kamera in einem Elektrochemilumineszenz-Detektionssystem (Table of Materials) und Aufzeichnung der Signalzählungen, die den relativen Lichteinheiten (RLU) entsprechen und direkt proportional zur Lichtintensität sind.
      Anmerkung: Bei elektrochemischer Stimulation emittiert die an die Kohlenstoffelektrode gebundene Rutheniummarkierung Lumineszenzlicht bei 620 nm. Analysieren Sie die Daten mit der gerätebegleitenden Software (Table of Materials).

Tabelle 1: Standardreihen von 0 bis 1.800 ng/ml.