Elektrochemilumineszenz-Assay zur Quantifizierung der Zielproteinspiegel im Gehirnlysat

Zusammenfassung

Quelle: Steinkellner, H., et al., Ein Elektrochemilumineszenz-basierter Assay für MeCP2-Proteinvarianten. J. Vis. Exp. (2020).

In diesem Video demonstrieren wir den Elektrochemilumineszenz-Immunoassay zur Quantifizierung von Zielproteinkonzentrationen in verschiedenen Proben. Dieser Assay basiert auf der Lumineszenz, die bei der elektrochemischen Reaktion erzeugt wird. Die Intensität des emittierten Lichts ist proportional zur Menge des Zielproteins in der Probe.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft

1. MeCP2-ECLIA-Protokoll

1. Herstellung der Waschlösung, des Blockierungspuffers und der Verdünnungslösung (Tag 1)
   1. 500 μl Tween 20 bis 1 l PBS zugeben, um ein 0,05%iges Tween 20 in PBS-Lösung herzustellen, kräftig mischen und als "Waschlösung" kennzeichnen.
      Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass nur frisch zubereiteter Waschpuffer verwendet wird.
   2. Bereiten Sie eine Blockierungslösung aus 3% Blocker A (Table of Materials)....

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
TAT-MeCP2-Fusionsprotein	Eigene Produktion		Zellbehandlung
MSD-Blocker A	Diagnose der Mesoskala	Nr. R93BA-4	Blocker
Tween 20	Sigma-Aldrich	Nr. P9416	Waschlösung
Polyklonales Anti-MeCP2, hergestellt in Kaninchen	Eurogentec S.A.	Maßgeschneidert	Antikörper
Monoklonales Anti-MeCP2, hergestellt in der Maus, Klon Mec-168, gereinigtes Immunglobulin	Sigma-Aldrich	M6818-100UL; RRID:AB_262075	Antikörper, Beschichtungslösung
Multi-Array 96-Well-Platte	Diagnose der Mesoskala	L15XB-3/L11BX-3	MeCP2 ECLIA-Protokoll
Sekundäres AB, Kaninchen, anti-MeCP2	Eurogentec S.A.	Gewohnheit	Antikörper
Sekundäres AB, Kaninchen, anti-MeCP2	Merck	Nr. 07-013	Antikörper
MeCP2 (human) rekombinantes Protein (P01)	Abnova AG	H00004204-P01	Zellbehandlung
Gold Read Buffer T (1x) mit Tensid	Diagnose der Mesoskala	R92TG	MeCP2 ECLIA-Protokoll
MSD SECTOR Imager 2400	Diagnose der Mesoskala	I30AA-0	MeCP2 ECLIA-Protokoll
Discovery Arbeitsbereich 4.0	Entdeckung der Mesoskala		Software
Dulbecco's PBS (steril)	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: D8537-500ML	Probenvorbereitung, Waschlösung, Beschichtungslösung
Edta	Sigma-Aldrich	Eds	Extraktions-Puffer