Digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion zum Nachweis von Indel-Mutationen in Zielgenen

Zusammenfassung

Quelle: Carballar-Lejarazú, R., et al. Digital-Tröpfchen-PCR zum Nachweis von Indels-Mutationen in genetisch veränderten Anophelin-Mückenpopulationen. J. vis. exp. (2021).

Dieses Video zeigt die Rolle der digitalen Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion bei der Identifizierung von Indel-Mutationen in einer DNA-Probe. Die hohe Präzision und Empfindlichkeit der ddPCR ermöglicht einen genauen und konsistenten Nachweis seltener Mutationen, die in einer Probe vorhanden sind, selbst bei geringen Konzentrationen. Es kann Indel-Mutationen in verschiedenen Regionen des Genoms identifizieren und quantifizieren und liefert wertvolle Einblicke in die Mechanismen der Mutation und die funktionellen Konsequenzen dieser Mutationen.

Protokoll

1. ddPCR-Reaktionen und Vorbereitung der Tröpfchenerzeugung

1. Quantifizieren Sie die DNA mit einem Fluorometer.
   Anmerkung: Für den Drop-off-Assay wird empfohlen, einen Bereich von 3.000 bis 30.000 haploiden Genomkopien pro Reaktion zu verwenden, der für den Nachweis von NHEJ-Ereignissen mit einer HEX-Markierungssonde ausgelegt ist, die an eine WT-Sequenz der Zielschnittstelle bindet und nicht abkühlt (Drop-off), wenn an der Zielstelle eine Deletion oder Insertion stattfindet. was auf das Vorhandensein einer NHEJ-Variante hinweist.
2. Berechnen Sie die Kopienzahl anhand des haploiden Genomgewichts und der DNA-Konzentration im Extrakt. Dies geschieht, indem die Konzentration der extrahierten DNA mit dem Volumen multipliziert wird, das zur Ermittlung der Gesamt-DNA-Masse verwendet wird, und es dann durch das haploide Genomgewicht dividiert wird. Stellen Sie sicher, dass das hinzugefügte Volumen zwischen 1 und 10 μl liegt. Verdünnen Sie nach Bedarf, um im empfohlenen Bereich der haploiden Genomkopie zu liegen.
   Anmerkung: Ein haploides Genom von Anopheles gambiae wird auf 0,27 pg pro erwachsener Mücke geschätzt.
3. Design-Primer und Sonden. Entwerfen Sie Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotid-Primer mit einer Primer-Schmelztemperatur (Tm) im Bereich von 55-60 °C, die die 5'- und 3'-Enden der gRNA-Zielstelle flankieren und ein Amplikon von 150-400 bp erzeugen.
   1. HEX (Hexachlorfluorescein)-markierte Sonde für die NHEJ-Detektion: Entwerfen Sie ein Oligonukleotid mit einer Länge von ~15-20 bp komplementär zur Zielstelle und fügen Sie die HEX-Sonde am 5'-Ende und BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) am 3'-Ende hinzu. Die Tm der Hydrolysesonde sollte 3-10 °C höher sein als die Tm der Primer.
   2. FAM (6-Carboxyfluorescein)-markierte Sonde als Referenz WT: Entwerfen Sie ein Oligonukleotid mit einer Länge von ~15-20 bp, das komplementär zu einer konservierten Genomstelle ist, die von der Zielstelle entfernt ist (ca. 25 bp), und fügen Sie die FAM-Sonde zum 5'-Ende und BHQ1 zum 3'-Ende hinzu. Die Tm der Hydrolysesonde sollte 3-10 °C höher sein als die Tm der Primer.

2. Vorbereitung der PCR-Reaktion

1. Bereiten Sie 25 μl des ddPCR-Probenmixes mit den folgenden Komponenten vor: ddPCR-Supermix für Sonden (ohne UTP): 12,5 μl, Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 μM): je 1 μL, HEX/FAM-Sonden (10 μM): je 0,625 μl, DNA: 1-5 μl (3.750-37.500 haploide Genomkopien) und Wasser: bis zu 25 μl.
2. Mischen Sie die Reaktionen gründlich durch Vortexen oder Refluxpipettieren (auf und ab) (20x).
   Anmerkung: Wenn die Reaktionen in einer 96-Well-Platte stattfinden, pipettieren Sie das gesamte Volumen 20 Mal auf und ab, anstatt es vortexen zu lassen, um Blasenbildung zu vermeiden.
3. Die Proben kurz zentrifugieren, um die Mischung am Boden des Röhrchens oder der Vertiefung abzusetzen.
   Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die Reaktionen bei Raumtemperatur stattfinden, damit die Tröpfchen erzeugt werden können. Bereiten Sie 1x ddPCR-Mischung für zusätzliche/unbenutzte Wells in jeder Kartusche vor (jede Kartusche hat 8 Wells).

3. Tröpfchen-Erzeugung

1. Laden Sie mit einer 50-μl-Mehrkanalpipette 20 μl der ddPCR-Probenmischung in die mittlere Reihe der Kartusche (Abbildung 1A, oben).
2. Laden Sie 70 μL des Öls in die untere Reihe. Laden Sie 20 μl 1x ddPCR-Supermix in ungenutzte Wells.
   Anmerkung: Führen Sie keine Blasen ein.
3. Platzieren Sie die Dichtung so, dass sie nur die Kanten berührt, und vermeiden Sie dabei den konkaven Bereich in der Mitte (Abbildung 1B).
4. Legen Sie die Platte fest in den Tröpfchengenerator und schließen Sie die Abdeckung, um den Lauf zu starten.
5. Übertragen Sie mit der Mehrkanalpipette 40 μl der Emersionsmischung aus der oberen Reihe der Kartusche (Abbildung 1A, unten) in die 96-Well-Platte.
   1. Ziehen Sie die flüssige Probe 3-5 s lang in einem Winkel von 45-30°. Die Mischung langsam über 3 s in einem Winkel von 45° in die Seite der Vertiefung ausstoßen und an der Seite heruntertropfen lassen. Es ist in Ordnung, zum zweiten Stopp (vollständiges Ausstoßen) der Pipette zu gehen, um die gesamte Flüssigkeit auszustoßen.
6. Versiegeln Sie die Platten mit Folien-Heißsiegeln für 5 s bei 180 °C.

4. PCR

1. Legen Sie die versiegelte Platte in den Thermocycler (Abbildung 1C) und stellen Sie die empfohlenen PCR-Bedingungen ein, wenn Sie die NHEJ-Drop-Off-Richtlinien befolgen, wie folgt:
   1. Erste Denaturierung bei 95 °C für 10 min.
   2. Stellen Sie 40 Zyklen von 94 °C für 30 s für die Denaturierung, 55 °C für 1 Minute für das Glühen und 60 °C für 2 Minuten für die Verlängerung ein.
   3. Bei 98 °C 10 min halten.
   4. Bei 4 °C halten.
      Anmerkung: Die Glühtemperatur für bestimmte Primer und Sondensätze kann durch einen thermischen Gradienten optimiert werden. Verwenden Sie für alle Schritte eine Rampenrate von 2 °C/s. Die PCR-Bedingungen sollten je nach Versuchsdesign und -aufbau angepasst werden.

5. Tröpfchen-Lesen

1. Legen Sie die Platte fest in den Tröpfchenleser, wobei sich die Vertiefung A-1 oben links befindet (geglättete Ecke, die anderen drei sind umrandet) (Abbildung 1D).
2. Richten Sie die Platte im Programm ein: Bestimmen Sie FAM als bekannten Referenzkanal und HEX als unbekannten (Abbildung 2A).
3. Führen Sie das Tröpfchenleseexperiment als direkte Quantifizierung durch. Ändern Sie nach Abschluss des Laufs den Versuchstyp für die Analyse in Drop-Off (DOF) (Abbildung 2A).

Ergebnisse

Abbildung 1: Versuchsaufbau und Ablauf. (A) Vorbereitung der Kartusche für die Tröpfchenerzeugung. (Nach oben) Die Proben werden in die mittlere Reihe der Kartusche eingefüllt, während das Öl in die untere Reihe eingefüllt wird. (Unten) Obere Reihe gefüllt mit emulgierten Tröpfchen nach der Tröpfchenerzeugung. (B) Tröpfchengenerator mit einer Kartusche, die mit de...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
reagenzien
ddPCR Super Mix für Sonden (kein dUTP)	Bio-Rad	1863024
EDTA (pH 8,0)	Invitrogen	AM9260G
Wasser in PCR-Qualität			Jedes zertifizierte Wasser in PCR-Qualität kann verwendet werden
Proteinase K 20 mg/ml	Thermo Fisher Scientific	AM2546
Materialien
ddPCR 96-Well-Platte	Bio-Rad	12001925
Tröpfchengenerator DG8 Kartusche und Dichtungen	Bio-Rad	1864007
Tröpfchenerzeugung Öl für Sonden	Bio-Rad	1863005
Fluoreszierende Sonden (z.B. FAM/HEX-Sonden)	Sigma-Aldrich	N/A	Sonden sind experimentierspezifisch und können bei jedem zertifizierten Händler erworben werden.
Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotid-Primer	Sigma-Aldrich	N/A	Primer sind experimentierspezifisch und können bei jedem zertifizierten Händler erworben werden.
Ausrüstung
C1000 Touch Thermocycler	Bio-Rad	1851148	Kann andere Thermocycler mit Gradientenfunktion und tiefem Brunnen verwenden