Gradientenpolymerase-Kettenreaktion zur Bestimmung der optimalen Glühtemperatur

Zusammenfassung

Quelle: Tsujimoto, H. et al., Indel-Nachweis nach CRISPR/Cas9-Mutagenese mittels hochauflösender Schmelzanalyse in der Mücke Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt die Gradientenpolymerase-Kettenreaktion zur Optimierung der Glühtemperatur von Primern, die die Gradientenglühtemperatur entlang der Vertiefungen einstellt. Die Wirkung unterschiedlicher Glühtemperaturen wird durch die Ausbeute an amplifizierten Produkten bestimmt, die zur Optimierung des Reaktionszustands beitragen.

Protokoll

1. Scannen nach Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), HRMA-Primer-Design und Primer-Validierung

1. SNP-Identifizierung in Wildtyp-Laborkolonie-Mücken
   1. Wählen Sie das Ziel-Exon aus, um die korrekte Polypeptidtranslation zu stören.
      Anmerkung: Das Ziel sollte sich in der Nähe des Startcodons oder unter den Schlüsselresten befinden, die für die Proteinfunktion erforderlich sind. Je kürzer das Exon ist (z. B. ≤200 Basen), desto schwieriger ist es, es zu identifizieren und zu analysieren. Vermeiden Sie Bearbeitungen in der Nähe der Grenzen eines Exons, da dies einen der HRMA-Primer dazu zwingt, entweder ein Intron zu durchqueren oder sich in einem Intron zu befinden. Dies ist unerwünscht, da die SNP-Raten in diesen Regionen tendenziell viel höher sind.
   2. Design der Grundierung
      1. Gehen Sie auf die NCBI Blast - Primer Blast Website, kopieren Sie das ausgewählte Exon und fügen Sie es in das Feld oben auf der Seite ein | wählen Sie die PCR-Produktgröße (stellen Sie sicher, dass es den größten Teil des Exons umfasst) | wählen Sie den Organismus aus.
      2. Klicken Sie auf Erweiterte Parameter | Entscheiden Sie sich für (für PCR-Produkt Tm) und fügen Sie 60 hinzu (für eine optimale Temperatur von 60 °C) | Holen Sie sich Primer. Behalten Sie die anderen Parameter als Standard bei.
   3. Gewinnung genomischer DNA (gDNA) aus der Wildtyp-Laborkolonie. Legen Sie 10 Mücken beiseite, betäuben Sie sie mit CO₂ und legen Sie sie in eine Petrischale auf Eis, um sie inaktiv zu halten. Stellen Sie 10 Röhrchen mit 0,5 μl des Reagenzes für die Freisetzung von DNA aus Gewebe und 20 μl Verdünnungspuffer bereit, die beide in dem in der Materialtabelle empfohlenen DNA-Freisetzungskit enthalten sind.
   4. Entfernen Sie mit einer Pinzette ein Bein von einer einzelnen Mücke und legen Sie es in ein entsprechendes Röhrchen mit einer verdünnten Lösung des DNA-Freisetzungsreagenzes (aus Schritt 1.1.3), wobei Sie das Bein vollständig in die Lösung eintauchen. Wiederholen Sie diesen Schritt mit den restlichen Mücken und wischen Sie die Pinzette mit 70% Ethanol ab, bevor Sie mit dem nächsten fortfahren.
   5. Die beinhaltige Lösung wird 2-5 min lang bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend 2 min lang bei 98 °C und während des Aufbaus der PCR-Reaktion abkühlen gelassen.
      Anmerkung: Platten, die die freigesetzte gDNA enthalten, können bei -20 °C gelagert werden, und das Protokoll kann zu diesem Zeitpunkt pausiert werden.
   6. Bereiten Sie 10 Röhrchen mit 10 μl 2x PCR-Mastermix, Primern mit einer Endkonzentration von 0,5 μM und Wasser in molekularer Qualität mit einem Endvolumen von 20 μl vor und geben Sie 1 μl der verdünnten Probe in jedes Röhrchen. Führen Sie die PCR nach diesen Zyklusparametern durch: 98 °C 5 min, 40 Zyklen von 98 °C für 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s pro kb; abschließende Verlängerung um 72 °C für 1 min.
   7. Reinigen Sie die PCR-Produkte mit einem Enzym, um die verbleibenden PCR-Primer abzubauen und überschüssige dNTPs oder ein beliebiges Säulenreinigungskit zu dephosphorylieren. Fahren Sie mit der Sequenzierung der Proben fort.
   8. Analysieren Sie jedes Elektropherogramm auf das Vorhandensein von Doppelpeaks/mehrdeutigen Basen und passen Sie die Basenaufrufe in jeder Sequenz manuell mit dem entsprechenden degenerierten Basiscode an.
      Anmerkung: Dieser Schritt muss vor dem Alignment mehrerer Sequenzen durchgeführt werden, da es üblich ist, dass die Base-Calling-Software den markanteren Peak als "wahren" Base-Call auswählt, was den falschen Eindruck erweckt, dass keine SNPs vorhanden sind.
   9. Führen Sie eine Ausrichtung mit mehreren Sequenzen mit der Ausrichtungssoftware SeqMan Pro durch, die in der Materialtabelle aufgeführt ist, oder mit einer anderen Open-Source-Ausrichtungssoftware wie ClustalW oder T-Coffe.
      1. Öffnen Sie die Ausrichtungssoftware | klicken Sie auf Sequenzen hinzufügen | wählen Sie die gewünschten Sequenzen aus und klicken Sie auf Hinzufügen | Sobald alle Sequenzen ausgewählt sind, klicken Sie auf Fertig.
      2. Klicken Sie auf Zusammenbauen, um die Ausrichtung durchzuführen. Um das Alignment zu öffnen, klicken Sie auf Contig 1 und analysieren Sie das Alignment und identifizieren Sie die SNPs (Abbildung 1).
         Anmerkung: Als Alternative zu den Schritten 1.1.3 bis 1.1.6 kann die PCR aus isolierter genomischer DNA durchgeführt werden, die aus Massenproben (von >10 Personen) gewonnen wurde. Sequenzierte Amplikons können direkt auf das Vorhandensein von SNPs analysiert werden, die als Doppelpeaks im Elektropherogramm erscheinen, obwohl seltene SNPs schwieriger zu erkennen sind.
   10. Entwerfen Sie 3-5 Single-Guide-RNAs (sgRNAs), wobei Regionen vermieden werden, die ein oben identifiziertes SNP enthalten, gemäß dem in beschriebenen Protokoll.

2. Gestaltung der HRMA-Grundierung

1. Testen Sie die Exon-Sequenz während der PCR mittels mFold auf die mögliche Bildung von Sekundärstrukturen.
   1. Gehen Sie zum UNAFold Webserver | klicken Sie auf mFold | klicken Sie im Dropdown-Menü auf Anwendungen | DNA-Faltungsform.
   2. Geben Sie den Sequenznamen in das Feld ein und fügen Sie das Exon ein.
   3. Ändern Sie die Falttemperatur auf 60 °C; ändern Sie unter ionischen Bedingungen [Mg⁺⁺] auf 1,5 und schalten Sie auf Einheiten auf mM um; klicken Sie auf DNA falten.
   4. Klicken Sie bei der Ausgabe unter Struktur 1 auf pdf, um die kreisförmigen Strukturdiagramme zu öffnen.
2. Gehen Sie zu NCBI Blast - Primer Blast für die Primer-Gestaltung.
3. Kopieren Sie die ausgewählte Exon-Sequenz, die durch die Sequenzierung in Schritt 1.1 bestimmt wurde (die Sequenz, die die geringste Anzahl von SNPs oder keine SNPs enthält), und fügen Sie sie in das Feld oben auf der Seite ein.
4. Verwenden Sie das Symbol < >, um Sequenzen zu markieren und auszuschließen, die SNPs, die Zielstelle und Regionen mit möglicher Bildung einer Sekundärstruktur enthalten.
5. Wählen Sie die PCR-Produktgröße zwischen 80 und 150 bp und wählen Sie den Organismus aus.
   Anmerkung: Größere Fragmentgrößen können erfolgreich verwendet werden (~300 bp). Längere Amplikons können jedoch die Empfindlichkeit zwischen Sequenzen verringern, die sich in einem oder nur wenigen Basenpaaren unterscheiden.
6. Klicken Sie auf Get Primers. Wählen Sie 2–3 Paare von Primern aus, die getestet werden sollen (idealerweise sind die Primerstellen ≥20–50 bp von den CRISPR-Zielstellen entfernt).

3. Primer-Validierung

1. Führen Sie eine Gradienten-PCR mit gDNA einer einzelnen Person durch.
   1. Bereiten Sie einen Mastermix vor und entnehmen Sie eine Probe für die Nicht-Template-Kontrolle (NTC) in einem separaten Röhrchen. Fügen Sie die Vorlage zum restlichen Mastermix hinzu und aliquotieren Sie sie in eine 96-Well-Platte.
   2. Befolgen Sie die Zyklusparameter: 98 °C 30 s, 34 Zyklen à 98 °C für 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; Endverlängerung von 72 °C für 10 min.
   3. Erzeugung von thermischen Schmelzeprofilen nach den Parametern: Denaturierungsschritt 95 °C für 1 min, Glühen 60 °C für 1 min, Schmelzkurvenerkennung zwischen 75 °C und 95 °C in Schritten von 0,2 °C, mit einer Haltezeit von 10 s bei jeder Temperatur.
      Anmerkung: Es sollten nur Glühtemperaturen mit einem einzigen thermischen Schmelzeprofil verwendet werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: SNP-Identifikation. Schematische Darstellung des Alignments mehrerer Sequenzen des AaeZIP11-Fragments aus dem Wildtyp. In Rot sind die SNPs und in Grün die Fragmente, die frei von SNPs sind; Diese SNP-freie Region wird für das Design von sgRNA und Primern empfohlen. Abkürzungen: SNP = Einzelnukleotid-Polymorphismus; sgRNA = einfache Leit-RNA; LVP = Liverpoole...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
70% Ethanol			70%ige Ethanollösung in Wasser
96-Well-PCR- und Real-Time-PCR-Platten	VWR	Tel.: 82006-636	Zur Gewinnung genomischer DNA (aus dem Mückenbein)
96-Well-Plattenschablonen			Hausgemachter Druck, für die Erfassung des Genotyps
Bio Rad CFX96	Bio Rad		PCR-Maschine mit Gradienten- und HRMA-Funktionen
Diversifizierte Biotech-Reagenzien-Reservoirs	VWR	Tel.: 490006-896
Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit	Neuengland Biolabore	E1050S
Petrischale aus Glas	VWR	Tel.: 89001-246	150 mm x 20 mm
Nunc Polyolefin-Acrylat-Dichtband, Thermo Scientific	VWR	Tel.: 37000-548	Zur Verwendung mit den 96-Well-PCR-Platten zur Gewinnung genomischer DNA
Phire Animal Tissue Direct PCR Kit (ohne Probenahmewerkzeuge)	Thermo Fischer	F140WH	Zur Gewinnung genomischer DNA und zur Durchführung von PCR
Software für die Präzisions-Schmelzeanalyse	Bio Rad	1845025	Wird zur Genotypisierung der DNA-Proben von Mücken und zur Analyse der thermischen Denaturierungseigenschaften von doppelsträngiger DNA verwendet (siehe Protokollschritt 3.3)
Einkanal-Pipettierer	Gilson
Phire Animal Tissue Direct PCR Kit (ohne Probenahmewerkzeuge)	Thermo Fischer	F140WH	Zur Gewinnung genomischer DNA und zur Durchführung von PCR
SeqMan Pro	DNAstar Lasergene Software		Für die Ausrichtung mehrerer Sequenzen
Einkanal-Pipettierer	Gilson