Digitale Duplex-PCR zur gleichzeitigen Quantifizierung dualer genetischer Marker

Abstract

Quelle: Cao, Y., et al. Ein Duplex Digital PCR Assay zur gleichzeitigen Quantifizierung des Enterococcus spp. und der humane fäkalassoziierte HF183-Marker in Gewässern. J. Vis. Exp. (2016)

In diesem Video demonstrieren wir die Duplex-Digital-PCR (ddPCR)-Technik — eine Modifikation der traditionellen PCR-Technik, die nützlich ist, um zwei verschiedene genetische Marker gleichzeitig zu detektieren. Eine einzelne PCR-Reaktion wird in nanolitergroße emulgierte Tröpfchen aufgeteilt, die unabhängig voneinander amplifiziert werden, und der Nachweis verschiedenfarbiger Fluoreszenzamplifikationssignale aus der Tröpfchenfraktion wird verwendet, um die Anfangskonzentration der Zielsequenzen zu berechnen.

Protocol

1. Vorbereitung der Assay-Mischung

1. 100 μmol/l Stammkonzentrationen für alle Primer in Wasser in molekularer Qualität und Sonden in TE pH 8-Puffer [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
   HINWEIS: Die Sonden für die beiden Targets sind mit unterschiedlichen Fluorophoren fluoreszenzmarkiert, wie in der Liste der Materialien/Geräte angegeben.
2. Bereiten Sie den Mastermix vor, indem Sie pro geplanter Reaktion 12 μl digitalen PCR-Mix (2x Lagerbestand, siehe Material-/Geräteliste), je 0,216 μl Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 0,06 μl je Fluoreszenzsonde und 5,016 μl nukleasefreies Wasser mischen (Endkonzentration: 900 nM pro Primer, 250 nM pro Sonde). Pipettieren Sie mindestens 10 Mal auf und ab, um zu mischen, und achten Sie darauf, keine Luftblasen in die Lösung zu bringen.
3. Pipettieren Sie den 18-μl-Mastermix (aus Schritt 1.2) in ein reguläres PCR-Röhrchen oder eine Platte und mischen Sie ein 6-μl-DNA-Template (extrahiert wie zuvor beschrieben) ein, um eine Assay-Mischung für die Tröpfchenerzeugung herzustellen. Wenn Sie Proben in Duplikaten ausführen, pipettieren Sie 36 μl Mastermix und 12 μl DNA-Template in jede Vertiefung. Lassen Sie die entsprechenden Repliz-Wells leer auf der Platte. Enthalten sind Positivkontrollen (siehe Liste der Materialien/Ausrüstungen) und keine Template-Kontrollen (NTC) (d. h. mit Wasser in molekularer Qualität als Vorlage).
   Anmerkung: Eine Positivkontrolle ist notwendig, um sicherzustellen, dass der Assay ordnungsgemäß läuft, und der NTC ist notwendig, um sicherzustellen, dass sich keine Kontamination in der Platte befindet und um die Fluoreszenz-Basislinie später in der Datenanalyse festzulegen. Erstanwendern wird empfohlen, sowohl unverdünnte als auch verdünnte DNA-Proben zu verwenden.

2. Tröpfchenerzeugung und PCR-Plattenaufbau

1. Mischen Sie die Assay-Mischungen, indem Sie mit einer Mehrkanalpipette etwa 15 Mal auf und ab pipettieren. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze in der Flüssigkeit bleibt, um übermäßige Blasen in der Mischung zu vermeiden.
2. Setzen Sie Kartusche 1 (mit 8 Vertiefungen) in einen weißen Kartuschenhalter ein und klicken Sie den Kartuschenhalter zu. Kartusche 1 sitzt nun fest und kann nicht aus der Halterung gelöst werden, während Tröpfchen entstehen. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig 20 μl der Assay-Mischung in die mittlere Position der Kartusche mit der Aufschrift "Probe", ohne Luftblasen einzuführen.
3. 70 μl Tröpfchenöl auf die linke Seite der Patrone pipettieren (mit "Öl" gekennzeichnet).
4. Decken Sie die Kartusche mit einer Dichtung ab und achten Sie darauf, dass die Dichtung flach ist und gleichmäßig von den 4 Häkchen zum Rand der Kartusche gehalten wird. Drücken Sie die grün leuchtende Taste am Tröpfchengenerator, um die Patrone zu öffnen und einzusetzen. Drücken Sie erneut die grün leuchtende Taste, um den Generator zu schließen.
   Anmerkung: Sobald die Tür schließt, wird der Knopf gedimmt, die Tür kann nicht wieder geöffnet werden und die Tröpfchenerzeugung beginnt sofort, die ca. 1 Minute andauert.
5. Wenn Sie mehr als 8 Reaktionen durchführen, setzen Sie Kartusche 2 in einen zweiten weißen Kartuschenhalter ein und bereiten Sie sie auf die gleiche Weise wie Kartusche 1 vor, während die Tröpfchenerzeugung ausgeführt wird, um Gesamteinrichtungszeit zu sparen.
6. Öffnen Sie die Klappe des Tröpfchengenerators, wenn die schwach beleuchtete Taste grün wird, um den Abschluss der Tröpfchenerzeugung anzuzeigen. Entfernen Sie den weißen Patronenhalter mit Patrone 1, legen Sie ihn beiseite und setzen Sie Patrone 2 auf den Tröpfchengenerator.
7. Entfernen Sie die Dichtung von Kartusche 1 und entsorgen Sie sie. Das Gesamtvolumen (ca. 40 μl) der erzeugten Tröpfchen aus der dritten Säule der Kartusche (gekennzeichnet mit "Tröpfchen") wird für den thermischen Wechsel vorsichtig auf eine endgültige PCR-Platte (bei Raumtemperatur gehalten) übertragen.
   Anmerkung: Lösen Sie den weißen Patronenhalter nicht, da die neu erzeugten Tröpfchen dadurch beschädigt werden können. Öffnen Sie den Patronenhalter erst, nachdem die Tröpfchen auf die endgültige Platte übertragen wurden.
8. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.7 für weitere Proben.
9. Wenn sich alle Tröpfchen in der endgültigen PCR-Platte befinden, legen Sie eine durchstechbare Folienabdeckung auf die Platte und legen Sie sie auf eine Plattenversiegelung. Stellen Sie das Versiegelungsmittel auf 180 °C ein, drücken Sie auf "Play" am Versiegelungsmittel und lassen Sie es 10 Sekunden lang versiegeln.

3. Thermische Zyklen und Tröpfchenauslesung

1. Platzieren Sie die versiegelte Platte auf dem Thermocycler, der mit der in Schritt 2.7 verwendeten endgültigen PCR-Platte kompatibel ist und eine Temperaturrampengeschwindigkeit von 2,0 °C/s aufweist.
2. Führen Sie das Wärmeprogramm wie folgt durch: 10 min bei 95 °C, gefolgt von 40 Zyklen à 30 sec bei 94 °C und 60 sec bei 60 °C, gefolgt von einem 10-minütigen Halten bei 98 °C (optional: endgültiges Halten bei 4 oder 15 °C).
3. Übertragen Sie die Platte nach Abschluss des Zyklus auf einen Tröpfchenleser, um die Fluoreszenz in jedem Tröpfchen in jeder Vertiefung automatisch zu messen. Alternativ können Sie die Platte bis zu 3 Tage lang bei 4 °C lagern, bevor Sie die Tröpfchenmessung durchführen. Stellen Sie sicher, dass die Tröpfchen Raumtemperatur haben, bevor Sie mit der Messung fortfahren.
   1. Öffnen Sie die mitgelieferte Software, um die Tröpfchenlesung einzurichten. Doppelklicken Sie im Standardmenü "Setup", das einen Schaltplan einer leeren 96-Well-Platte enthält, auf Well A1, um das Menü mit den drei Abschnitten "Probe", "Assay 1" und "Assay 2" zu öffnen.
   2. Geben Sie im Abschnitt "Beispiel" die Beispiel-ID in das Feld "Name" ein und drücken Sie die Eingabetaste oder aktivieren Sie das Kontrollkästchen rechts mit der Aufschrift "Übernehmen". Klicken Sie anschließend auf das Dropdown-Menü mit der Bezeichnung "Experiment" und wählen Sie "ROT" (Erkennung seltener Ereignisse) und klicken Sie auf die Eingabetaste.
   3. Wechseln Sie zu dem Abschnitt mit der Bezeichnung "Assay 1". Geben Sie im Abschnitt "Name" den Assay (z. B. Enterokokken) ein und klicken Sie auf die Eingabetaste. Klicken Sie im Feld unten mit der Bezeichnung "Typ" auf das Dropdown-Menü und wählen Sie "Kanal 1 Unbekannt" und klicken Sie auf die Eingabetaste.
   4. Wechseln Sie zu dem Abschnitt mit der Bezeichnung "Assay 2". Geben Sie im Abschnitt "Name" den Assay (z. B. HF183) ein und klicken Sie auf die Eingabetaste. Klicken Sie im Feld unten mit der Bezeichnung "Typ" auf das Dropdown-Menü, wählen Sie "Kanal 2 Unbekannt" und drücken Sie die Eingabetaste. Alle Informationen aus den Schritten 3.3.2 bis 3.3.4 sind jetzt in Vertiefung A1 vorhanden.
   5. Benennen Sie alle nachfolgenden Vertiefungen, die Tröpfchen enthalten. Um die gesamte Einrichtungszeit zu sparen, klicken Sie auf "Umschalt" oder "Strg", um mehrere Wells gleichzeitig auszuwählen.
   6. Wenn die digitale Darstellung der Platte die physische Platte widerspiegelt, drücken Sie "OK" unten rechts im Menü. Wählen Sie im neuen Menü, das oben im Schaltplan der Platte angezeigt wird, im Abschnitt "Vorlage" die Option "Speichern unter" und benennen und speichern Sie die Platte.
   7. Klicken Sie links auf dem Bildschirm auf "Ausführen" und wählen Sie das entsprechende Farbset im Popup-Fenster "Ausführungsoptionen" aus. Die Datenerfassung wird in Echtzeit in der Software initiiert und angezeigt.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroröhrchen mit geringer Bindung	Costar	3207	Zur Lagerung von Reagenzien, Proben/Herstellung von Mastermixen
Nukleasefreies Wasser	FisherSci	Nr. BP2484-50
TE pH 8 Puffer	FisherSci	Nr. BP2473-100
96-Well-Hartschalenplatte	BioRad	HSP-9601	Für den ersten Mastermix und die Probeninokulation
Aluminium-Siegelfolie	BioRad	Tel.: 359-0133	Zum Verschließen der Probenplatte
Tröpfchen-Generator	BioRad	Tel.: 186-3002
Öl zur Tröpfchenerzeugung	BioRad	Tel.: 186-3005
Patrone	BioRad	Tel.: 186-4008
DG8 Patronenhalter	BioRad	Tel.: 186-3051
Dichtung	BioRad	Tel.: 186-3009
20 μl Pipettenspitzen	Rainin	GP-L10F	Zum Tansferring von Probe/Mastermix auf Kartusche
200 μl Pipettenspitzen	Rainin	GP-L200F	Zum Übertragen von Tröpfchen auf die finale Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96-Well-Platte	Eppendorf	951020320	Für abschließende Tröpfchen, thermische Zyklen und Ablesungen
Durchstechbare Heißsiegelfolie	BioRad	Tel.: 181-4040	Zur Abdichtung der Twin.Tec-Platte vor dem thermischen Wechsel
PX1 PCR-Plattenversiegelung	BioRad	Tel.: 181-4000	Es wird nur der Thermocycler benötigt, keine Optik
CFX96 Thermocycler	BioRad	CFX96 und C1000
QX100 Tröpfchen-Lesegerät	BioRad	Tel.: 186-3001
Tröpfchen-Leseöl	BioRad	Tel.: 186-3004
Tröpfchen-PCR-Supermix	BioRad	Tel.: 186-3024	d.h. der digitale PCR-Mix im Manuskript
QuantaSoft Software (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	Zum Anzeigen, Analysieren und Exportieren von ddPCR-Daten
Entero Forward Primer (Ent F1A)	operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Alternativer Anbieter kann verwendet werden
Entero Reverse Grundierung (Ent R1)	operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Alternativer Anbieter kann verwendet werden
Entero Sonde (GPL813TQ)	operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Es kann ein anderer Anbieter verwendet werden, aber das Fluorophor muss FAM sein
HF183 Vorne Primer (HF183-1)	operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Alternativer Anbieter kann verwendet werden
HF183 Reverse Primer (BthetR1)	operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Alternativer Anbieter kann verwendet werden
HF183 Sonde (BthetP1)	operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Es kann ein alternativer Anbieter verwendet werden, aber das Fluorophor muss HEX sein (bei Verwendung von VIC muss die geeignete Matric-Kompensation gewählt werden).
Positive Kontrolle			Mischung aus genomischer DNA von E.faecalis und HF183-Standardplasmid (bestellt bei IDT). Für detaillierte Methoden zur Kultivierung von E. faecalis und Sequenzen des geordneten HF183-Plasmids siehe Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Im Handel erhältliche Enterokokken-DNA-Standards (ATCC 29212Q-FZ) können in der Positivkontrolle anstelle von im Labor hergestellter genomischer E. faecalis-DNA verwendet werden.