1. Quantifizierung von RNA mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer
- Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen des Spektralphotometers auf RNA eingestellt sind.
- Verwenden Sie 1-2 μl molekulares Wasser, um das Gerät zu initialisieren und eine Ausgangsbasis festzulegen.
- Verwenden Sie 1-2 μl jeder Test-RNA-Probe, um die RNA-Menge zu bestimmen.
- Speichern Sie die Messwerte und das Dokument.
- Stellen Sie die RNA bei Bedarf auf 1 μg/μl ein.
Anmerkung: RNA muss immer auf Eis (oder in einem kühlen Block) aufbewahrt werden. Wenn RNA mit einer Säule oder einer Bead-basierten Methode gewonnen wird, beträgt die RNA in der Regel weniger als 1 μg/μl. In dieser Situation verwenden Sie die RNA pur.
2. Vorbereitung von RNA-Verdünnungsreihen zur Bestimmung der Endpunktempfindlichkeit
- Machen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung der RNA.
- Markieren Sie die Röhrchen mit der Verdünnungsreihe (z. B. 10-1, 10-2 usw.) und den RNA-Details.
- Geben Sie 45 μl molekulares Wasser in jedes Röhrchen.
- 5 μl der RNA (zuvor auf 1 μg/μl verdünnt) zugeben und gut mischen.
- Entsorgen Sie die Pipettenspitze in dem entsprechenden Desinfektionsmittel und ersetzen Sie sie durch eine frische Spitze.
- Nehmen Sie 5 μl aus dem 10-1 und geben Sie es in das 10-2 Röhrchen und mischen Sie es gut.
- 2.1.3-2.1.5 mit den restlichen Verdünnungen wiederholen.
HINWEIS: RNA muss immer auf Eis (oder in einem kühlen Block) aufbewahrt werden.
3. Vorbereitung von Echtzeit-RT-PCR-Reaktionen
- Planen Sie anhand einer Tabellenkalkulation das Plattenlayout entsprechend der Anzahl der Test- und Kontrollproben sowohl für den Lyssavirus- als auch für den ß-Aktin-Assay.
Anmerkung: Sollen 4 Proben doppelt mit Positiv- und Negativkontrolle untersucht werden, entspricht dies 10 Reaktionen für beide Assays.
- Wischen Sie die Oberflächen vor der Verwendung in einem "Reinraum" oder einem vom RNA-Template getrennten Bereich mit einem geeigneten Desinfektionsmittel ab oder bereiten Sie einen PCR-Arbeitsplatz vor (falls verwendet). Um den Arbeitsplatz vorzubereiten, wischen Sie die Schrankoberfläche mit einem geeigneten Desinfektionsmittel ab, legen Sie die benötigten Gegenstände in den Arbeitsplatz und schließen Sie die Türen. Schalten Sie das UV-Licht für 10 Minuten ein.
- Regenten und Primer aus dem Gefrierschrank nehmen und auftauen (Reagenzien in Tabelle 1 und Primer in Tabelle 2).
HINWEIS: Die Enzymmischung wird in Glycerin gelagert, muss also nicht aufgetaut werden und muss immer auf Eis (oder in einem kühlen Block) aufbewahrt werden. Alle anderen Reagenzien können bei Raumtemperatur aufgetaut werden.
- Nach dem Auftauen die Reagenzien mischen und kurz zentrifugieren, um die Flüssigkeit aufzufangen.
HINWEIS: Den Enzymmix nicht wirbeln, sondern nur kurz zentrifugieren.
- Bereiten Sie separate Mastermixe für Lyssavirus und ß-Aktin vor. Für jede Reaktion fügen Sie 7,55 μl Wasser in molekularer Qualität, 10 μl 2x Universal SYBR grüne Reaktionsmischung, 0,6 μl Forward-Primer, 0,6 μl Reverse-Primer und 0,25 μl iTaq RT-Enzymmischung hinzu.
- Verwenden Sie eine Tabelle, um die korrekten Volumina zu berechnen, um Fehler bei der manuellen Berechnung zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass genügend Mastermix vorbereitet ist, um Pipettierfehler auszugleichen. Wenn also 10 Reaktionen erforderlich sind (siehe ANMERKUNG in 3.1), 12 Reaktionen vorbereiten
- Bereiten Sie den Master-Mix auf Eis (oder in einem kühlen Block) zu und bleiben Sie auf Eis, bis er in die Echtzeitmaschine gelegt wird.
- Mischen Sie die vorbereiteten Mastermixe, zentrifugieren Sie kurz und dosieren Sie 19 μl in die entsprechenden Vertiefungen von Streifenröhrchen oder eine 96-Well-Platte, die mit der verwendeten Echtzeitmaschine kompatibel ist.
HINWEIS: Minimieren Sie die Produktion von Blasen in den Wells während des Pipettierens.
- In einem separaten Raum oder in einem UV-Schrank, der wie in 3.2 beschrieben vorbereitet wurde, wird vorsichtig 1 μl der RNA unter die Oberfläche der entsprechenden Mastermix-Vertiefung gegeben und vorsichtig gemischt. Entsorgen Sie die Pipettenspitze direkt nach Gebrauch in das Desinfektionsmittel (unter der Oberfläche).
- Fügen Sie die Kontrollen nach den Testproben hinzu, wobei die Positivkontrolle als nächstes und die Kontrolle ohne Vorlage (NTC – Wasser in molekularer Qualität) zuletzt hinzugefügt wird. Die Menge der verwendeten RNA kann je nach Probentyp und verwendeter RNA-Extraktion geändert werden. Die verwendete Menge muss validiert werden, um sicherzustellen, dass die Reaktion optimiert wird.
- Versiegeln Sie die Platte mit Streifendeckeln oder Versiegelungsgeräten, wobei darauf zu achten ist, dass alle Deckel fest verschlossen und ausreichend beschriftet sind, um die Proben auszurichten. Beschriften Sie den Rand der Platten-/Streifenrohre.
- Schleudern Sie die Proben mit einer Zentrifuge herunter, um die gesamte Flüssigkeit am Boden der Vertiefungen aufzufangen.
- Übertragen Sie die Platte in das real-time PCR-Gerät, öffnen Sie die Tür und setzen Sie sie in die Halterung ein, um die korrekte Position/Ausrichtung der Proben entsprechend dem Plattenlayout zu gewährleisten.
HINWEIS: Wenn Rohrstreifen verwendet werden, stellen Sie sicher, dass der Halter an Ort und Stelle ist.
- Öffnen Sie das Programm für die Echtzeit-PCR-Maschine und wählen Sie die Option für das SYBR-Echtzeitexperiment mit Dissoziationskurve. Programmieren Sie das Echtzeit-PCR-Gerät unter Verwendung der in Tabelle 3 angegebenen Temperaturwechselbedingungen, einschließlich der Datenerfassungspunkte.
- Wählen Sie SYBR als Fluoreszenzfarbstoff und als Probentyp unbekannt aus und geben Sie einen Namen in das Feld für den korrekten Probennamen ein.
Anmerkung: Unterscheiden Sie zwischen den Replikaten und auch zwischen den Lyssavirus- und ß-Aktin-Vertiefungen.
- Wählen Sie einen Speicherort für die experimentellen Daten, stellen Sie sicher, dass die Lampe am Ende des Laufs ausgeschaltet wird, und starten Sie dann den Lauf.
HINWEIS: Da es sich bei dem ersten Schritt um eine RT-Phase handelt, werden während dieser Zeit keine Daten gesammelt, daher kann dies während der RT-Phase auftreten, wenn die Lampe eine Aufwärmphase benötigt. Die Echtzeitmaschine und die Software zeigen die Verstärkungskurven in Echtzeit an, während die Schmelzkurve am Ende des Zyklus generiert wird.
