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1. DNA-Extraktion aus FFPE-Gewebe, peripherem Blut und Knochenmarkaspirat
- Für FFPE-Gewebe im Knochenmark mit DNA-FFPE-Extraktionskit
- Beginnen Sie mit FFPE-Gewebe von ungefärbten Objektträgern (5 - 10 Schnitte mit 5 - 10 μm Dicke).
Anmerkung: Wenn Sie mit Gewebespänen beginnen, verwenden Sie 3 - 6 Schnitte mit einer Dicke von 5 - 10 μm und fahren Sie mit Schritt 1.1.6 fort.
- Legen Sie die Objektträger in einen Objektträgerkorb und bereiten Sie vier Spülbehälter vor (zwei für Xylol und zwei für 100%igen Alkohol). Geben Sie ein Mindestvolumen von 600 ml der Lösung in jeden Korb.
- Entparaffinieren Sie die Objektträger, indem Sie eine 5-minütige Xylolwäsche in der ersten Schale durchführen. Übertragen Sie die Objektträger für weitere 5 Minuten in das zweite Xylol-Waschreservoir.
- Nach der Entparaffinierung die Objektträger 5 min lang mit 100%igem Alkohol waschen. Übertragen Sie die Objektträger für weitere 5 min in das zweite Alkoholwaschreservoir
.
- Lassen Sie die Objektträger unter einer Haube vollständig trocknen, bevor Sie sie mit einer Rasierklinge in ein Mikrozentrifugenröhrchen schaben.
Anmerkung: Wenn ein H&E-Objektträger mit der angegebenen Tumorregion verfügbar ist, richten Sie die Objektträger aus und kratzen Sie nur die Tumorregion ab.
- Fahren Sie mit den Anweisungen aus dem Herstellerhandout fort, das im Kit enthalten ist.
- Für BM-Aspirat und peripheres Blut
- Extrakt gemäß den Anweisungen des Herstellers mit diesen Spezifikationen.
Anmerkung: Es gibt zahlreiche kommerziell erhältliche Kits und Methoden zur DNA-Extraktion aus FFPE-Geweben und -Zellen. Praktisch können alle verwendet werden. Verwenden Sie eine Methode, die im Labor etabliert ist.
- Verwenden Sie 200 μl peripheres Blut (PB) oder 100 μl BM + 100 μl PBS.
- Verwenden Sie 4 μl RNase A Stammlösung.
- Eluieren mit 100 μL Elutionspuffer.
- DNA-Quantifizierung
- Messen Sie die DNA-Konzentrationen mit einem Spektralphotometer, das ein Verhältnis von 260 nm/280 nm von ca. 1,8 (für reine DNA) gewährleistet. Wenn das Verhältnis deutlich niedriger ist, kann dies auf das Vorhandensein von Proteinen, Phenol oder anderen Verunreinigungen hinweisen, die nachgelagerte Anwendungen beeinträchtigen können.
- Passen Sie die DNA-Konzentrationen mit entsprechendem Elutionspuffer auf ca. 50 - 100 ng/μl an.
2. Wildtyp-blockierende PCR
- Grundierung Design
- Entwerfen und erhalten Sie Primer für Gene von Interesse gemäß den zuvor beschriebenen allgemeinen Richtlinien für das PCR-Primer-Design. Aufnahme von M13-Vorwärts- und Rückwärts-Universalsequenzierungsprimern in PCR-Primer.
Anmerkung: Der MYD88-Assay wurde entwickelt, um das Exon 5 von MYD88 (G259 - N291) und 110 Nukleotide zu amplifizieren, die sich im 5'-Intronikbereich befinden, um die Spleißstelle und einen Teil von Intron 4 abzudecken. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer wurden mit einer 5'-M13-Sequenz (M13- vorwärts: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-reverse: cag gaa aca gct atg acc), um das Glühen von komplementären Sequenzierungsprimern zu ermöglichen (siehe Materialtabelle).
- Design von Oligonukleotiden mit gesperrten Nukleinsäuren
- Das blockierende Oligonukleotid ist so zu gestalten, dass es etwa 10 - 15 Basen lang ist und komplementär zum WT-Template ist, wo eine Mutantenanreicherung gewünscht ist.
Anmerkung: Ein kürzeres Oligo wird die Diskriminierung von Diskrepanzen verbessern. Um eine hohe Zielspezifität zu erreichen, ist es wichtig, nicht zu viele blockierende Nukleotide zu verwenden, da dies zu einem sehr "klebrigen" Oligonukleotid führen kann. Der Gehalt sowie die Länge und das blockierende Nukleotid sollten entsprechend dem spezifischen Nukleotid, das blockiert werden muss, optimiert werden. Es ist wichtig, eine hohe Bindungsspezifität zu erreichen, ohne die Sekundärstruktur zu beeinträchtigen und die Selbstkomplementarität zu gefährden.
- Das Blockierungsoligo ist so zu gestalten, dass es während des Thermocyclings einen Tm 10 - 15 °C über der Dehnungstemperatur hat. Passen Siedas TM an, indem Sie blockierende Basen hinzufügen oder entfernen oder indem Sie die DNA durch blockierende Basen ersetzen, wobei lange Abschnitte (3 - 4 Basen) von blockierenden G- oder C-Basen vermieden werden.
- Navigieren Sie zur Website der Oligo-Tools (siehe Materialtabelle) und wählen Sie das Tool "Blocking Oligo Tm Prediction" aus.
- Fügen Sie die Sequenz der LB-Vorlage, die blockiert werden soll, in das Feld "Oligo-Sequenz" ein. Fügen Sie ein "+" vor die Bases ein, um die Blocker-Bases anzuzeigen.
- Wählen Sie die Schaltfläche "Berechnen", um den ungefähren Tm des DNA-Blocker-Hybriden zu bestimmen.
- Gestalten Sie das blockierende Oligo so, dass die Bildung von Sekundärstrukturen oder Selbstdimeren vermieden wird.
- Navigieren Sie zur Website der Oligo-Tools (siehe Materialtabelle) und wählen Sie das Tool "Oligo Optimizer blockieren" aus.
- Fügen Sie die Reihenfolge der LB-Vorlage, die gesperrt werden soll, in das Feld ein. Fügen Sie ein "+" vor den Basen hinzu, um das Blockieren der Basen anzuzeigen.
- Aktivieren Sie die beiden Kontrollkästchen für "Sekundärstruktur" und "Nur Selbst". Klicken Sie auf die Schaltfläche Analysieren, um das Oligo auf potenziell störende Sekundärstrukturen oder Selbstdimere zu überprüfen.
Anmerkung: Die Werte stellen sehr grobe Schätzungen der Tm's der Sekundärstrukturen und Selbstdimere dar. Niedrigere Werte sind daher optimal und können durch eine Begrenzung der Blocker-Blocker-Paarung erreicht werden. Das blockierende Oligonukleotid für MYD88 [MYD88-Blocker (TCAGA+AG+C+G+A+T+G+A+T+CC/invdT/)] wurde entwickelt, um die Aminosäuren Q262-I266 abzudecken und verfügt über ein 3'-invertiertes dT, um sowohl die Verlängerungen durch DNA-Polymerase als auch den Abbau durch 3'-Exonuklease zu hemmen. Dieses spezifische blockierende Oligo ist ein 17-mer mit 10 blockierenden Basen, die als "+N" bezeichnet werden. Die restlichen 7 Basen sind gewöhnliche DNA-Nukleotide.
- WTB-PCR Aufbau und Thermocycling
- Bereiten Sie einen WTB-PCR-Mastermix (MMX) mit 2,5 μl PCR-Reaktionspuffer 10x mit 20 mM MgCl2, 250 μM dNTPs, 0,2 μM Forward- und Reverse-Primer, 1,2 μM MYD88-Blocker und DNAse, RNAse-freiem, ultrareinem H2O vor, um ein endgültiges Lösungsvolumen von 21,75 μl pro Reaktion zu erhalten.
Anmerkung: Die Arbeitskonzentrationen beziehen sich auf das endgültige Reaktionsvolumen von 25 μl (nach Zugabe des DNA-Templates und der Polymerase). Bei der herkömmlichen PCR MMX wird einfach auf die Zugabe eines Blockers verzichtet. Alle Protokollschritte bleiben sowohl für die WTB als auch für die konventionelle PCR identisch. Dies kann zur Validierung und Bestimmung der Anreicherung verwendet werden, die durch die Zugabe eines Blockers erreicht wird.
- Bei der Berechnung der Menge an MMX, die zubereitet werden muss, ist darauf zu achten, dass 3 zusätzliche Reaktionen (Positiv- und Negativkontrollen und eine Nicht-Template-Kontrolle zur Überprüfung auf Kontamination) und mindestens 1 zusätzliche Reaktion auf Pipettierfehler berücksichtigt werden.
- Vortex MMX gründlich. Der MMX kann bis zu einem Jahr bei -80 °C gelagert werden.
- 0,25 μl Taq-DNA-Polymerase pro Reaktion zum MMX geben und zum Mischen invertieren. Sobald die Polymerase zum MMX hinzugefügt wurde, bewahren Sie es auf Eis auf.
- Legen Sie eine neue 96-Well-PCR-Platte auf eine Kühlplatte und pipettieren Sie 22 μl MMX mit der Polymerase in jede Reaktionsvertiefung.
- Geben Sie 3 μl genomische DNA (50 - 100 ng/μl) in jede der Vertiefungen, die das MMX mit der Polymerase enthalten.
- Verschließen Sie die Platte und zentrifugieren Sie kurz, um sicherzustellen, dass die Lösung den Boden jeder Vertiefung erreicht.
- Laden Sie die PCR-Platte auf einen Thermocycler.
- Die Thermocycling-Bedingungen für die WTB-PCR-Reaktion sind wie folgt einzustellen: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 6 min; 40 Zyklen Denaturierung bei 95 °C für 30 s, Primerglühen bei 56 °C für 30 s und Extension bei 72 °C für 1 min 20 s; endgültige Verlängerung bei 72 °C für 10 min.
Anmerkung: Best Practice besteht darin, den Rest des Protokolls in einem physisch getrennten Bereich durchzuführen, um eine Kontamination mit Amplikons in zukünftigen Setups zu vermeiden.