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1. qPCR-Reaktionen vorbereiten
HINWEIS: Eine PCR-Reaktion gilt für eine Probe. Jede PCR-Reaktion enthält 5 μl qPCR-Mastermix (siehe Materialien), 1 μl 5 μM Primerpaar-Mix, 2 μl H2O und 2 μl wärmebehandelte T7-Phagenprobe. Für mehrere PCR-Reaktionen werden alle Reagenzien mit Ausnahme der Phagenprobe in einem 1,5-ml-Röhrchen vorgemischt. Das Volumen jedes Reagenzes in der Vormischung hängt von der Anzahl der Phagenproben für die qPCR ab.
- Bereiten Sie die qPCR-Vormischung für 10 biopanierte Phagenproben mit unbekannter Konzentration und 7 Proben mit Standardkonzentrationen in dreifacher Ausfertigung vor. Als Ergebnis gibt es insgesamt 51 Proben und damit 51 qPCR-Reaktionen (d. h. eine Reaktion pro Probe). Bereiten Sie für 51 Reaktionen einen Premix aus 255 μl qPCR-Mastermix (51 x 5 μl), 51 μl Primern (51 x 1 μl) und 102 μl H2O (51 x 2 μl) vor.
Anmerkung: Es wird empfohlen, einige zusätzliche PCR-Reaktionen vorzubereiten, um den Volumenverlust während der Aliquotierung der PCR-Mischung in jede Vertiefung der 96-Well-qPCR-Platte auszugleichen.
- Aliquotieren Sie 8 μl PCR-Vormischung in jede Vertiefung der 96-Well-qPCR-Platte, um insgesamt 51 Vertiefungen (d. h. 51 qPCR-Reaktionen) zu erhalten. Es ist nicht notwendig, die Spitzen während der Aliquotierung zu wechseln.
- Geben Sie 2 μl wärmebehandelte T7-Phagenproben oder T7-Phagen-Referenz-DNA in jede Vertiefung (Abbildung 1B); ändern Sie die Spitzen, wenn Sie verschiedene DNA-Proben in die Vertiefung geben, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Geben Sie außerdem die 2-μl-DNA-Proben unter die Oberfläche der qPCR-Vormischung (d. h. in die 8-μl-PCR-Vormischung).
- Versiegeln Sie die qPCR-Platte mit Klebefolie.
Anmerkung: Dieser Schritt ist unabhängig von der Art der qPCR-Platte von entscheidender Bedeutung. Verwenden Sie das empfohlene Kit, um die Platte vollständig abzudichten. Andernfalls führt jeder nicht versiegelte Bereich in der Platte während des PCR-Zyklus zu Volumenverlust.
- Wickeln Sie die qPCR-Platte mit Aluminiumfolie ein, um das Fluoreszenz-Photobleichen zu minimieren, und fahren Sie mit dem Ausführen auf dem qPCR-Gerät fort.
2. Bedingungen für den qPCR-Zyklus
HINWEIS: Die qPCR-Zyklusbedingungen wurden auf dem spezifischen qPCR-Gerät eingerichtet.
- Führen Sie die 96-Well-qPCR-Platte auf dem qPCR-Gerät aus. Wählen Sie am Gerät im Menü die Option "Einstellungen" aus, um die folgenden Versuchsbedingungen einzurichten (Abbildung 1C).
- Für ein Probenvolumen von 10 μl sind die Zyklusbedingungen wie folgt einzustellen: ein Zyklus bei 50 °C für 2 Minuten, ein Zyklus bei 95 °C für 2 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen (95 °C für 15 s, 60 °C für 1 min). Führen Sie anschließend die Einstellungen der Schmelzkurve aus: einen Zyklus von 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 min und 95 °C 15 s.
- Fahren Sie mit der Analyse der Daten fort.
