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1. Asymmetrische PCR zur Amplifikation von ssDNA
- Bereiten Sie eine asymmetrische PCR-Reagenzienmischung für die Amplifikation der zu analysierenden ssDNA vor. Tauen Sie die Reagenzien in Tabelle 1 auf Eis auf. Bewahren Sie das Taq-Polymerase-Enzym (50 U/μL) nicht auf Eis auf, sondern lagern Sie es bis zur Verwendung bei 20 °C.
- Alle Reagenzien vorsichtig vortexen und dann die Röhrchen bei 10.000 x g 10 s lang kurz zentrifugieren.
- Kombinieren Sie alle Reagenzien wie in Tabelle 1 beschrieben.
- Die Proben werden in einen Thermocycler gegeben und die asymmetrische PCR unter folgenden Bedingungen gestartet: 25 Zyklen (95 °C für 30 s, 52 °C für 30 s und 72 °C für 30 s), 85 °C für 5 Minuten, halten bei 4 °C.
2. Mikrosphären-PCR zur Amplifikation von ssDNA
HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt das Protokoll für die Amplifikation von ssDNA in einem PCR-Reaktionsröhrchen. Mikrosphären-PCR-Reaktionen wurden bei einem Reaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt. Die detaillierten Sequenzen, die zur Amplifikation von ssDNA verwendet werden, sind in Tabelle 2 aufgeführt. In diesem Fall kann Ap auf der Oberfläche von Mikrosphären komplementär an zufällige DNA-Templates andocken. Dies ist ein sehr wichtiger Schritt für die Herstellung komplementärer DNA-Stränge (Antisense-DNA-Strang, Abbildung 1). Die verlängerte DNA wird als Template für die Mikrosphären-PCR-Amplifikation verwendet.
- Bereiten Sie eine Mikrosphären-PCR-Reagenzmischung vor. Tauen Sie die Reagenzien in Tabelle 3 auf Eis auf; Bewahren Sie das Taq-Polymerase-Enzym jedoch nicht auf Eis auf. Bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
- Alle Reagenzien vorsichtig vortexen und dann die Röhrchen bei 10.000 x g 10 s lang kurz zentrifugieren.
- Erhalten Sie ca. ~25 Mikrokügelchen durch mikroskopische Zählung.
Anmerkung: Die Anzahl der Mikrokügelchen in einem Reaktionsgefäß wird mit einem Lichtmikroskop mit 40-facher Vergrößerung berechnet. Etwa ~25 Mikrosphären werden für die Mikrosphären-PCR-Amplifikation verwendet. Genauere Informationen finden Sie in Schritt 3.
- Kombinieren Sie alle Reagenzien wie in Tabelle 3 beschrieben.
- Die Proben werden in einen Thermocycler gegeben und die asymmetrische PCR unter folgenden Bedingungen gestartet: 25 Zyklen (95 °C für 30 s, 52 °C für 30 s und 72 °C für 30 s), 85 °C für 5 Minuten, halten bei 4 °C.
- Nach der Amplifikation fügen Sie 8 μl 6x Ladepuffer hinzu und laden Sie 15 μl jeder Probe in 2 % Agarosegel. Führen Sie dann eine Elektrophorese bei 100 V für 35 min in 1x TAE (Tris-Acetat-EDTA, 40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, pH 8,2) Puffer durch.
Tabelle 1. Asymmetrisches PCR-Reagenz mischt Komponenten in einer 20-μl-Reaktion.
kg
kg
| Reagenz | Volumen für 1x Reaktion (μL) | Endkonzentration |
| Zufällige DNA-Vorlage | 1 | 1 ng/μL |
| Grundierung nach vorne | 1 | 0,4 μM |
| Umgekehrte Grundierung | 1 | 0,02 μM |
| 10x Taq-Puffer | 5 | 1-mal |
| 10 mM dNTP | 4 | ca. 2,5 Mio. m |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 HE |
| Wasser | 37,8 | - |
| gesamt | Nr. 50 | - |
Tabelle 2. Sequenzinformationen für die Mikrosphären-PCR.
| Schablone | Reihenfolge | Länge (nt) |
| Zufällige DNA-Vorlage | 5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (Zufällige Sequenz, 40 Monate) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | Nr. 76 |
| Tag-Forward-Grundierung (Tag-F) | 5'- GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| Umgekehrte Grundierung | 5'- AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
Tabelle 3. Mikrosphären-PCR Reagenzienmischung Komponenten in 50 μL Reaktion
kg
kg
| Reagenz | Volumen für 1x Reaktion (μL) | Endkonzentration |
| Ap-Mikrosphären | ~25 Mikrosphären | - |
| Zufällige DNA-Vorlage | 1 | 1 ng/μL |
| Tag-Forward-Grundierung | 1 | 0,4 μM |
| 10x Taq-Puffer | 5 | 1-mal |
| 10 mM dNTP | 4 | ca. 2,5 Mio. m |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 HE |
| Wasser | 37,8 | - |
| gesamt | Nr. 50 | - |
