Mikrosphären-Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifikation einzelsträngiger DNA

Zusammenfassung

Quelle: Lee, S. H. et al., Ein tröpfchenbasierter mikrofluidischer Ansatz und Mikrosphären-PCR-Amplifikation für einzelsträngige DNA-Amplikone. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt die Technik zur Amplifikation einzelsträngiger DNA unter Verwendung von Oligonukleotid-beschichteten Polymer-Mikrosphären in einer Einzelrohrreaktion. Bei diesem Verfahren entsteht reine einzelsträngige DNA, die für die DNA-Sequenzierung und Microarray-Analyse weiterverwendet werden kann.

Protokoll

1. Asymmetrische PCR zur Amplifikation von ssDNA

1. Bereiten Sie eine asymmetrische PCR-Reagenzienmischung für die Amplifikation der zu analysierenden ssDNA vor. Tauen Sie die Reagenzien in Tabelle 1 auf Eis auf. Bewahren Sie das Taq-Polymerase-Enzym (50 U/μL) nicht auf Eis auf, sondern lagern Sie es bis zur Verwendung bei 20 °C.
2. Alle Reagenzien vorsichtig vortexen und dann die Röhrchen bei 10.000 x g 10 s lang kurz zentrifugieren.
3. Kombinieren Sie alle Reagenzien wie in Tabelle 1 beschrieben.
4. Die Proben werden in einen Thermocycler gegeben und die asymmetrische PCR unter folgenden Bedingungen gestartet: 25 Zyklen (95 °C für 30 s, 52 °C für 30 s und 72 °C für 30 s), 85 °C für 5 Minuten, halten bei 4 °C.

2. Mikrosphären-PCR zur Amplifikation von ssDNA

HINWEIS: Dieser Abschnitt beschreibt das Protokoll für die Amplifikation von ssDNA in einem PCR-Reaktionsröhrchen. Mikrosphären-PCR-Reaktionen wurden bei einem Reaktionsvolumen von 50 μl durchgeführt. Die detaillierten Sequenzen, die zur Amplifikation von ssDNA verwendet werden, sind in Tabelle 2 aufgeführt. In diesem Fall kann Ap auf der Oberfläche von Mikrosphären komplementär an zufällige DNA-Templates andocken. Dies ist ein sehr wichtiger Schritt für die Herstellung komplementärer DNA-Stränge (Antisense-DNA-Strang, Abbildung 1). Die verlängerte DNA wird als Template für die Mikrosphären-PCR-Amplifikation verwendet.

1. Bereiten Sie eine Mikrosphären-PCR-Reagenzmischung vor. Tauen Sie die Reagenzien in Tabelle 3 auf Eis auf; Bewahren Sie das Taq-Polymerase-Enzym jedoch nicht auf Eis auf. Bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.
2. Alle Reagenzien vorsichtig vortexen und dann die Röhrchen bei 10.000 x g 10 s lang kurz zentrifugieren.
3. Erhalten Sie ca. ~25 Mikrokügelchen durch mikroskopische Zählung.
   Anmerkung: Die Anzahl der Mikrokügelchen in einem Reaktionsgefäß wird mit einem Lichtmikroskop mit 40-facher Vergrößerung berechnet. Etwa ~25 Mikrosphären werden für die Mikrosphären-PCR-Amplifikation verwendet. Genauere Informationen finden Sie in Schritt 3.
4. Kombinieren Sie alle Reagenzien wie in Tabelle 3 beschrieben.
5. Die Proben werden in einen Thermocycler gegeben und die asymmetrische PCR unter folgenden Bedingungen gestartet: 25 Zyklen (95 °C für 30 s, 52 °C für 30 s und 72 °C für 30 s), 85 °C für 5 Minuten, halten bei 4 °C.
6. Nach der Amplifikation fügen Sie 8 μl 6x Ladepuffer hinzu und laden Sie 15 μl jeder Probe in 2 % Agarosegel. Führen Sie dann eine Elektrophorese bei 100 V für 35 min in 1x TAE (Tris-Acetat-EDTA, 40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, pH 8,2) Puffer durch.

Tabelle 1. Asymmetrisches PCR-Reagenz mischt Komponenten in einer 20-μl-Reaktion.

kg kg

Reagenz	Volumen für 1x Reaktion (μL)	Endkonzentration
Zufällige DNA-Vorlage	1	1 ng/μL
Grundierung nach vorne	1	0,4 μM
Umgekehrte Grundierung	1	0,02 μM
10x Taq-Puffer	5	1-mal
10 mM dNTP	4	ca. 2,5 Mio. m
Ex taq (1000U)	0,2	1 HE
Wasser	37,8	-
gesamt	Nr. 50	-

Tabelle 2. Sequenzinformationen für die Mikrosphären-PCR.

Schablone	Reihenfolge	Länge (nt)
Zufällige DNA-Vorlage	5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (Zufällige Sequenz, 40 Monate) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3'	Nr. 76
Tag-Forward-Grundierung (Tag-F)	5'- GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3'	42
Umgekehrte Grundierung	5'- AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3'	18

Tabelle 3. Mikrosphären-PCR Reagenzienmischung Komponenten in 50 μL Reaktion

kg kg

Reagenz	Volumen für 1x Reaktion (μL)	Endkonzentration
Ap-Mikrosphären	~25 Mikrosphären	-
Zufällige DNA-Vorlage	1	1 ng/μL
Tag-Forward-Grundierung	1	0,4 μM
10x Taq-Puffer	5	1-mal
10 mM dNTP	4	ca. 2,5 Mio. m
Ex taq (1000U)	0,2	1 HE
Wasser	37,8	-
gesamt	Nr. 50	-

Ergebnisse

Abbildung 1: Illustration des Mikrosphären-PCR-Protokolls.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
40% Acrylamid:bis-Lösung (19:1)	Bio-rad	1610140	Bestandteile der copolymerisierbaren Oligo-Mikrosphäre
Ammoniumpersulfat, APS	Sigma Aldrich	Nr. A3678	Härter aus Acrylamid:bis-Lösung
N,N,N′,N′- Tetramethylethylendiamin, TEMED	Sigma Aldrich	Nr. T9281	Katalysator von Ammoniumpersulfat
Mineralöl	Sigma Aldrich	M5904	Tabelle 1. Lösung III. Bestandteil von Mikrosphären-Reagenzien
ssDNA-Acrydit-markierte Sonde	Bioneer	synthetisiert	Tabelle 1. Lösung I. Bestandteil von Mikrosphären-Reagenzien
Tris	Biosesang	Nr. T1016	Bestandteile von TE-Puffer, pH-Pufferlösung
Edta	Sigma Aldrich	Eds	Bestandteile des TE-Puffers, Entfernung von Ionen (Ca2+)
Ex Taq	Takara	RR001A	ssDNA-Amplifikation
T100 Thermocycler	Bio-rad	1861096	ssDNA-Amplifikation