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1. Reverse Transkription der viralen RNA
- Nehmen Sie die in Tabelle 1 aufgeführten RT-Reagenzien aus dem Gefrierschrank, bewahren Sie sie auf Eis auf und tauen Sie sie vor der Verwendung auf und wirbeln Sie sie auf.
- Bereiten Sie 12 μl RT-Reaktionsmischung in einem 0,2-ml-PCR-Röhrchen mit den in Tabelle 1 aufgeführten Reagenzien vor. Ermöglichen Sie Variationen beim Pipettieren, indem Sie ein Volumen des Mastermixes vorbereiten, das mindestens eine Reaktionsgröße größer als erforderlich ist.
- Geben Sie 8 μl Probe, Positivkontroll-RNA oder Negativkontrolle in den RT-Reaktionsmix in einer PCR-Workstation in einem Template-Raum. Die RT-Positivkontrolle ist RNA, die aus der Zellkultur extrahiert wird, die mit dem fixierten RABV-Stamm CVS-11 (Challenge-Virus-Standard-11) infiziert und bei -80°C gelagert wird. Die Negativkontrolle enthält RNase-freies ddH2O.
- Mischen Sie den Inhalt der RT-Röhrchen durch Vertexen und zentrifugieren Sie dann kurz.
- Laden Sie die Reaktionsgefäße in einen Thermocycler. Richten Sie das cDNA-Syntheseprogramm unter den folgenden Bedingungen ein: 42 °C für 90 Minuten, 95 °C für 5 Minuten und 4 °C in der Warteschleife. Stellen Sie das Reaktionsvolumen auf 20 μl ein. Starten Sie den RT-Lauf.
2. PCR der ersten Runde
- Bewahren Sie die in Tabelle 2 aufgeführten PCR-Reagenzien bis zur Verwendung in einem Reinraum auf Eis auf. Tauen Sie sie dann auf und wirbeln Sie sie vortexen.
- Bereiten Sie die PCR-Mischung der ersten Runde in einem 0,2-ml-PCR-Röhrchen mit den in Tabelle 2 aufgeführten Reagenzien vor.
- Geben Sie eine 2-μl-Probe von cDNA oder Plasmid in den PCR-Mix der ersten Runde in einer PCR-Workstation in einem Template-Raum. Bei der PCR-Positivkontrolle handelt es sich um CVS-11 cDNA, die wie in Schritt 1.3 für die obige RT-Methode hergestellt wurde. Die PCR-Negativkontrolle beträgt dd H2O.
- Übertragen Sie die versiegelten Röhrchen in einen PCR-Thermocycler und durchlaufen Sie den Zyklus unter Verwendung der in Tabelle 3 aufgeführten Parameter.
3. PCR der zweiten Runde
- Bereiten Sie die PCR-Mischung der zweiten Runde in einem 0,2-ml-PCR-Röhrchen unter Verwendung der in Tabelle 4 aufgeführten Reagenzien vor.
- Geben Sie 2 μl des PCR-Produkts der ersten Runde in die PCR-Mischung der zweiten Runde. Fügen Sie zusätzlich dd H2O als Negativkontrolle der Zweitrunden-PCR hinzu.
- Führen Sie das PCR-Thermocycling mit den gleichen Parametern wie in Schritt 2.4 angegeben durch.
Tabelle 1: Reagenzien der reversen Transkription für die cDNA-Synthese.
kg
kg
| Bestandteil | Volumen pro Reaktion (μl) |
| dNTPs (2,5 mM ) | 4 |
| Zufälliger Primer (50 μM) | 1,5 |
| Oligo(dT) 15 (50 μM) | 0,5 |
| M-MLV-Puffer (5x) | 4 |
| M-MLV reverse Transkriptase (200 IE/μl) | 1 |
| RNasin (40 IE/μL) | 1 |
| Gesamtvolumen | 12 |
Tabelle 2: Reagenzien der Erstrunden-PCR.
kg
kg
| Bestandteil | Volumen pro Reaktion (μl) |
| dNTPs (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Taq-Puffer (10x) | 5 |
| N127 (20 μM) | 1 |
| N829 (20 μM) | 1 |
| dd H2O | 39,7 |
| Gesamtvolumen | 48 |
Tabelle 3: Cycling-Parameter der Erst- und Zweitrunden-PCR
| Temperatur | Zeit | Zyklus |
| 94 °C | 2 Minuten | 1 |
| 94 °C | 30 Sek. | 35 |
| 56 °C | 30 Sek. | 35 |
| 72 °C | 40 Sek. | 35 |
| 72 °C | ca. 10 Minuten | 1 |
| 4 °C | ∞ | |
Tabelle 4: Reagenzien der Zweitrunden-PCR.
kg
kg
| Bestandteil | Volumen pro Reaktion (μl) |
| dNTPs (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Taq-Puffer (10x) | 5 |
| N371F (20 μM) | 1 |
| N371R (20 μM) | 1 |
| dd H2O | 39,7 |
| Gesamtvolumen | 48 |