Hochauflösende Schmelz-PCR zur Bestimmung von Sequenzvariationen in mutierten DNA-Sequenzen

Zusammenfassung

Quelle: Kisserli, A., et al. Hochauflösende Schmelz-PCR für die Genotypisierung von Komplementrezeptor-1-Längenpolymorphismen: Ein innovatives Werkzeug zur Bewertung der Genempfindlichkeit der Alzheimer-Krankheit. J. Vis. Exp. (2017).

In diesem Video beschreiben wir eine hochauflösende Schmelz-PCR-Technik zur Bestimmung des Längenpolymorphismus von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Sequenzlängen, basierend auf einer Schmelztemperaturanalyse.

Protokoll

1. HRM-PCR-Protokoll

1. Tauen Sie die DNA-Proben auf. Verdünnen Sie die DNA-Proben in 1,5-ml-Röhrchen mit Wasser, um sie auf eine Konzentration von 10 ng/μL
   Anmerkung: Das Gesamtvolumen der verdünnten DNA sollte zwischen 2 μl und 10 μl liegen.
2. Tauen Sie die Grundierungslösungen auf. Die Grundierungslösungen werden in 1,5-ml-Röhrchen mit Wasser verdünnt, um sie auf die gleiche Konzentration von 6 μM.
   einzustellen. Anmerkung: Die Primersequenzen und Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
3. Tauen Sie die HRM-PCR-Kit-Lösungen auf und mischen Sie sie vorsichtig durch Vortexen, um die Rückgewinnung des gesamten Inhalts sicherzustellen. Die drei Fläschchen mit dem enzymatischen Gemisch mit dem DNA-Bindungsfarbstoff MgCl₂ und Wasser in einer Mikrozentrifuge kurz drehen, bevor sie geöffnet werden. Lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
4. Bereiten Sie den PCR-Mix in einem 1,5-ml-Röhrchen bei Raumtemperatur für eine 20-μl-Reaktion vor, indem Sie die folgenden Komponenten in der unten aufgeführten Reihenfolge hinzufügen:
   1. 10 μl enzymatisches Gemisch mit DNA-Bindungsfarbstoff;
   2. 2 μl 25 mM MgCl₂;
   3. 1 μl Primer 1, 6 μM (Endkonzentration: 300 nM);
   4. 1 μl Primer 2, 6 μM (Endkonzentration: 300 nM) und
   5. 5 μl Wasser.
      Anmerkung: Um den PCR-Mix für mehr als eine Reaktion vorzubereiten, multiplizieren Sie die oben genannten Volumina mit der Anzahl der auszuführenden Reaktionen plus einer zusätzlichen Reaktion.
5. Vorsichtig durch Vortexen mischen.
6. Pipettieren Sie 19 μl der oben vorbereiteten PCR-Mischung in jede Vertiefung einer weißen Multiwell-Platte.
7. 1 μl konzentrationsangepasstes DNA-Template zugeben.
   Anmerkung: Führen Sie für Kontrollreaktionen immer eine Negativkontrolle mit den Proben durch. Um eine Negativkontrolle vorzubereiten, ersetzen Sie die Matrizen-DNA durch Wasser.
8. Verschließen Sie die weiße Multiwell-Platte mit Siegelfolie.
9. Legen Sie die weiße Multiwell-Platte in die Zentrifuge und balancieren Sie sie mit einem geeigneten Gegengewicht (z. B. einer anderen Multiwell-Platte) aus. Zentrifuge für 1 min bei 1.500 x g in einer Standard-Ausschwingzentrifuge mit einem Rotor für Multiwell-Platten mit geeigneten Adaptern.
10. Legen Sie die weiße Multiwell-Platte in das HRM-PCR-Gerät ein.
11. Starten Sie das HRM-PCR-Programm mit den folgenden PCR-Bedingungen:
    Denaturierung: 95 °C für 10 min; 1 Zyklus.
    Verstärkung: 95 °C für 10 s, 62 °C für 15 s und 72 °C für 20 s; 47 Zyklen.
    Schmelzkurve: 95 °C; Rampengeschwindigkeit: 0,02 °C/s; 25 Erfassungen pro °C; 1 Zyklus.
    Kühlung: 40 °C für 30 s; Rampengeschwindigkeit 2,2 °C/s; 1 Zyklus.

Tabelle 1: Primer und Parameter, die in der hochauflösenden Schmelzanalyse verwendet werden.

>2. HRM-Analyse zur Bestimmung des CR1-Längenpolymorphismus

HINWEIS: Die beschriebene Methodik (Abbildung 1) ist spezifisch für unsere Software (siehe Materialtabelle), obwohl auch andere Softwarepakete verwendet werden können.

1. Öffnen Sie eine Gen-Scan-Software, um die CR1-Längenpolymorphismus-Scan-Analyse durchzuführen.
2. Öffnen Sie das Experiment, das das Amplifikationsprogramm und das Schmelzkurvenprogramm enthält.
3. Klicken Sie in der Modulleiste auf Probeneditor und wählen Sie dann den Scan-Workflow aus.
4. Definieren Sie die Eigenschaften der Proben (z. B. Name, unbekannte oder negative Kontrolle).
5. Klicken Sie in der Modulleiste auf Analyse.
6. Wählen Sie in der Liste Neue Analyse erstellen die Option Genscan aus.
7. Klicken Sie auf die Registerkarte Normalisierung, um die Schmelzkurven zu normalisieren.
8. Klicken Sie auf die Registerkarte Temperaturverschiebung, um die Temperaturachse (x-Achse) der Schmelzkurven zurückzusetzen.
   Anmerkung: Das untere Diagramm zeigt Schmelzkurven, die sowohl normalisiert als auch temperaturverschoben sind.
9. Klicken Sie auf die Schaltfläche Berechnen, um die Ergebnisse zu analysieren und die Gruppierung festzulegen.
10. Klicken Sie auf die Registerkarte Differenzdiagramm im Diagrammbereich, um die normalisierten und verschobenen Schmelzkurven und das Diagramm der normalisierten und temperaturverschobenen Differenz anzuzeigen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Screenshots der grafischen Oberfläche der Software, die in Schritt 2 des Protokolls verwendet wurde. (A) Öffnen Sie die Genscan-Software. (B) Amplifikationsprogramm und Schmelzkurvenprogramm. (C) Klicken Sie in der Modulleiste auf Sample-Editor. (D) Wählen Sie Scannen aus. (E) Definieren...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Laborkittel			Schutz
SensiCareIce puderfreie Nitril-Untersuchungshandschuhe	Medline Industries, Inc., Mundelein, IL 60060, USA	486802	Schutz von Proben
Eppendorf Reference 2 Pipette, 0,5-10μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Frankreich	4920000024	Pipettieren von Proben
Eppendorf Reference 2 Pipette, 20-100μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Frankreich	4920000059	Pipettieren von Proben
Eppendorf Reference 2 Pipette, 100-1000μL	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Frankreich	4920000083	Pipettieren von Proben
TipOne 10μL Graduiert, Filterspitze	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Deutschland	Nr. S1121-3810	Pipettieren von Proben
TipOne 1-100μL abgeschrägt, Filterspitze	Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Deutschland	Nr. S1120-1840	Pipettieren von Proben
ART 1000E Absperrspitze	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Frankreich	2079E	Pipettieren von Proben
Eppendorf Safe-Lock Röhrchen, 1,5 mL, Eppendorf Qualität	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Frankreich	30120086	mischen
Vortex-Genie 2	Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA	SI-0236	mischen
Mikro 200 Zentrifuge	Hettich Zentrifugen, D-78532, Deutschland	0002020-02-00	Zentrifugation
Multipette E3	Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Frankreich	4987000010	Verteilung
Light Cycler 480 Multiwell-Platte 96, weiß	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Deutschland	4729692001	Reaktionsort
Light Cycler 480 Siegelfolie	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Deutschland	4429757001	Berichterstattung
LightCycler 480 Instrument II, 96 Well	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Deutschland	05015278001	Hochauflösende Schmelzpolymerase-Kettenreaktion
Heraeus Megafuge 11R Zentrifuge	Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Frankreich	75004412	Zentrifugation
LightCycler 480 Hochauflösender Schmelzmeister	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Deutschland	04909631001	Reaktionsreagenzien
CN3 Grundierung: 5'ggccttagacttctcctgc 3'	Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, Belgien		Reaktions-Reagenz
CN3re Grundierung: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3'	Eurogentec Biologics Division, B4102 Seraing, Belgien		Reaktionsreagenzien
Software für Light Cycler 480 SW 1.5.1	Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Deutschland		Software für die Analyse von HRM-PCR CR1-Polymorphismen