Multiplex-Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion zum Nachweis der DNA-Methylierung in Leukozyten

Zusammenfassung

Quelle: Malic, L., et al. Methylierungsspezifische Multiplex-Tröpfchen-PCR mit Polymer-Tröpfchen-Generator-Gerät für die hämatologische Diagnostik.J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video demonstriert die Multiplex-Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktionstechnik zur gleichzeitigen Quantifizierung von methylierten DNA-Regionen in verschiedenen Populationen weißer Blutkörperchen als frühen Biomarker für die klinische Diagnose und Prognose.

Protokoll

1. Tröpfchenerzeugung und PCR

HINWEIS: Tabelle 1 enthält Informationen zu den Vorwärts- und Rückwärtsprimern zusammen mit den doppelt gequenchten Hydrolysesonden für die Gene C-LESS, CD3Z und Foxp3, die für die Multiplexamplifikation von demethylierten Genzielen erforderlich sind.

1. Bereiten Sie den Mastermix wie in Tabelle 2 beschrieben vor.
2. Tauen Sie alle Bestandteile des Mastermixes mit Ausnahme des Enzymmixes auf. Mischen Sie den Mastermix gründlich, indem Sie ihn von oben nach unten pipettieren und kurz herunterschleudern.
3. Geben Sie das entsprechende Volumen (1 μl) an Bisulfit-umgewandelter DNA in ein PCR-Röhrchen zum Mastermix. Mischen Sie die Reaktion, indem Sie von oben nach unten pipettieren und kurz nach unten schleudern.
4. Verbinden Sie Einweg-Fluidschläuche (Innendurchmesser 0,25 mm, Außendurchmesser 1,6 mm) mit zwei Präzisionsglasspritzen (250 μl Volumen) mithilfe von PEEK-Anschlüssen.
5. Füllen Sie eine Präzisionsglasspritze mit 250 μl Trägeröl mit 5 % Fluortensid vor.
6. Füllen Sie eine weitere Präzisionsglasspritze mit 50 μl Trägeröl vor, bevor Sie 100 μl des PCR-Mixes laden, um sicherzustellen, dass das gesamte Probenvolumen während der Emulgierung abgegeben wird.
7. Richten Sie ein mikrofluidisches Tröpfchengerät auf einem Tisch eines aufrechten Lichtmikroskops ein, das mit einer Hochgeschwindigkeitskamera ausgestattet ist, um die Tröpfchenbildung in Echtzeit zu beobachten und aufzuzeichnen.
8. Setzen Sie die vorgefüllten Spritzen auf die programmierbare Spritzenpumpe und verbinden Sie den Schlauch der Spritzen mit Hilfe der PEEK-Verbindung mit den Armaturen (siehe Materialtabelle) mit den Schläuchen der jeweiligen Einlasskanäle des mikrofluidischen Tröpfchengeräts.
9. Legen Sie den Schlauch aus dem Auslass des Tröpfchengenerators in ein 0,5-ml-PCR-Röhrchen.
10. Stellen Sie die Durchflussrate der Spritzenpumpe auf 2 μl/min ein und lassen Sie die Tröpfchengröße stabilisieren, bevor Sie die resultierende Emulsion auffangen.
11. Sammeln Sie die Emulsion und übertragen Sie 75 μl in ein 0,2-ml-PCR-Röhrchen für den thermischen Zyklus.
12. Stellen Sie sicher, dass der Ölgehalt im PCR-Röhrchen genau mit dem Volumen der dispergierten Phase übereinstimmt, um das Verschmelzen der Tröpfchen während des thermischen Zyklus zu verhindern.
13. Legen Sie das 0,2-ml-PCR-Röhrchen in einen Thermocycler und führen Sie das Zyklusprotokoll wie folgt durch: Vorwärmen bei 95 °C für 5 Minuten, dann 45 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 15 s und Glühen/Verlängern bei 60 °C für 30 s.

Tabelle 1: Design des Primers und der Hydrolysesonde.

FOXP3 Vorwärts	GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG
FOXP3 Rückwärtsgang	TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA
CD3Z Vorwärts	GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG
CD3Z Rückwärtsgang	CAA AAA CTC CTT TTC TCC TAA CCA
C-LESS Vorwärts	TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA
C-LESS Rückwärtsgang	TTT CTT CCA CCC CTT CTC CTC C
FOXP3-Sonde	/56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/
CDZ3 Sonde	/56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/
C-Less-Sonde	/56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/

Tabelle 2: Master-Mix-Rezept für mdPCR.

Reagenz	Stammlösung	Master-Mix-Lautstärke	Arbeitskonzentration
Tris-HCl	1 Mio.	2 μL	ca. 20 mM
Kcl	1 Mio.	10 μL	ca. 100 mM
MgCl2	ca. 25 mM	16 μL	ca. 4 mM
C-LESS Grundierungen	10 μM	10 μL	je 1 μM
CD3Z Grundierungen	10 μM	10 μL	je 1 μM
FOXP3 Grundierungen	10 μM	10 μL	je 1 μM
C-LESS-Sonde	10 μM	5 μL	500 nM
CD3Z-Sonde	10 μM	5 μL	500 nM
FOXP3-Sonde	10 μM	5 μL	500 nM
HotStarTaq DNA-Polymerase	5 Einheiten/μL	8 μL	0,4 Einheiten/μl
Bisulfit-behandeltes DNA-Ziel	Variable	Variable	Variable
Nukleasefreies Wasser		Variable
Gesamtvolumen		100 μL

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
PCR-Röhrchen	Bio-Rad, Mississauga, ON	TFI0201
Fluor-Tensid	RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-Fluortensid
Flüssiger Einwegschlauch	Dolomit	3200063
Flüssiger Einwegschlauch	Dolomit	3200302
PEEK-Verschraubungen	IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA	P-881
Trägeröl	3M, St. Paul, Vereinigte Staaten von Amerika
Aufstehendes Lichtmikroskop	Nikon, Melville, Vereinigte Staaten von Amerika