Chip-in-a-Tube-basierte digitale PCR zur Quantifizierung von Einzelnukleotidvarianten

Zusammenfassung

Quelle: Kahyo, T., et al. Digitaler Polymerase-Kettenreaktions-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiären Patienten mit adenomatöser Polyposis unter Verwendung des Chip-in-a-Tube-Formats. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert die Nützlichkeit der digitalen PCR in einem Chip-in-a-Tube-Format für den Nachweis von Einzelnukleotidvariationen in DNA-Proben. Eine einzelne PCR-Reaktion wird in Kammern aufgeteilt, die als unabhängige PCR-Reaktionen fungieren, und die Detektion von Fluoreszenzsignalen von den amplifizierten Zielen in den Kammern wird verwendet, um die Häufigkeit des varianten Allels in der Probe zu berechnen.

Protokoll

1. Qualitätskontrolle der genomischen DNA

HINWEIS: Genomische DNA (gDNA) wurde aus peripherem Blut mit der etablierten DNA-Aufreinigungsmethode auf Basis von Kieselsäuremembranen extrahiert. Im Vorfeld der folgenden Verfahren wurde die Konzentration der gDNA mit einem Spektralphotometer bestimmt.

1. Bereiten Sie die gDNA-Probe in einer Konzentration von 10-100 ng/μl vor.
2. Geben Sie 10 μl DNA-Probenpuffer in einen 8-Röhrchen-Streifen.
3. Geben Sie 1 μl DNA-Leiter oder gDNA in die Röhrchen. Wirbeln Sie die Mischung 1 Minute lang mit dem Mikrotiterplatten-Aufsatz vor.
4. Legen Sie das Röhrchen, das Gelgerät und die Pipettenspitzen in das Elektrophoresegerät (Materialtabelle) und starten Sie den Lauf, indem Sie die Start-Taste drücken.
   Anmerkung: Das Elektrophoresesystem funktioniert automatisch mit einem Klick auf die Schaltfläche Start.
5. Vergewissern Sie sich, dass der im DNA-Probenpuffer enthaltene untere Marker in den Elektropherogrammen korrekt zugeordnet ist. Wenn er falsch zugewiesen ist, weisen Sie den Marker manuell im "Elektroherogramm-Modus" der Software zu.
   Anmerkung: Die DNA-Integritätsnummer (DIN) wird automatisch berechnet. Der DIN-Wert ergibt sich aus der DNA-Integrität. Hohe und niedrige DIN-Werte deuten auf eine hochintakte bzw. stark abgebaute gDNA hin.
6. Geben Sie die Größenregion der gDNA (> 200 bp) im "Region-Modus" der Software an, um die Konzentration der gDNA (> 200 bp) automatisch zu berechnen.

2. Primer- und Sondendesign

1. Berechnen Sie die Werte der Schmelztemperatur (_{T m}) mit einem frei zugänglichen Tool unter den folgenden Bedingungen: 10-25 Basen, 50 mM Na⁺/K⁺, 0,80 mM dNTPs und 3 mM Mg²⁺ (Materialtabelle). Design der Forward- und Reverse-Primer zur Amplifikation der genomischen Region, die Zielallele enthält, mit einem_T-m-Wert von etwa 60 °C und einer Amplikonlänge von 100-300 bp.
   HINWEIS: Die Konzentration der Oligonukleotide ist in Tabelle 1 aufgeführt.
2. Entwerfen Sie die Sonden für gesperrte Nukleinsäuren (LNA) für die Referenz- und Variantenallele basierend auf den folgenden Bedingungen: (i) In jeder Sonde sind 1-6 LNAs vorhanden; ii) ein Fluoreszenzfarbstoff und ein Quencher sind an den 5'- bzw. 3'-Terminus jeder Sonde vorhanden; iii) die Differenz zwischen den_T-m-Werten der übereinstimmenden und der nicht übereinstimmenden Sonde beträgt > 10 °C; (iv) Die_T-m-Werte der übereinstimmenden und nicht angepassten Sonden sind höher bzw. niedriger als die der Primer [z. B. Forward-Primer: 60,8 °C, Reverse-Primer: 59,8 °C, Referenz-Allel-Sonde (angepasst/nicht angepasst): 62,6/45,3 °C, Varianten-Allel-Sonde (angepasst/nicht angepasst): 61,7/50,5 °C]. Die_T-m-Werte wurden mit dem Open-Access-Tool berechnet, das auch für Schritt 2.1 verwendet wurde.
3. Stellen Sie sicher, dass die entworfenen Primer und Sonden nicht die Einzelnukleotid-Polymorphismen mit einer Häufigkeit von > 0,1 % umfassen, die aus Datenbanken [z. B. der Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP)] ermittelt wurden.

3. Digitale PCR

1. Bereiten Sie die Primer, Sonden und gDNA-Stammlösungen in den in Tabelle 1 beschriebenen Konzentrationen mit einem TE-Puffer vor und lagern Sie sie bei -20–4 °C.
2. Mischen Sie die Reagenzien bei Raumtemperatur in einem Gesamtvolumen von 15 μl bis zu einer Endkonzentration, wie in Tabelle 1 beschrieben.
   1. 3 μl destilliertes Wasser anstelle von gDNA in einer No-Template-Kontrolle (NTC) zugeben.
   2. Bereiten Sie die 3,5-fache Menge der PCR-Mischung in dreifacher Ausfertigung vor, um den Pipettierfehler zu berücksichtigen.
3. Pipettieren Sie die PCR-Mischung auf und ab, um sie zu mischen.
4. Setzen Sie die Ladeplattform auf die in der 8-Rohr-Leiste eingebauten Späne und stellen Sie diese auf den Autoloader. Stellen Sie sicher, dass ein Kontakt zwischen dem Span und der Ladefläche besteht.
5. Montieren Sie einen Ladeschieber auf der Plattform und halten Sie den Schieber mit dem Stopper vom Lader ab.
6. Pipettieren Sie 15 μl des PCR-Gemischs auf der Plattform in der Nähe der Spitze des Schiebers (Abbildung 1A).
7. Lassen Sie den Lader laufen, indem Sie den Knopf des Laders drücken (ca. 1 Min.).
   Anmerkung: Es ist kein Problem, wenn eine kleine Menge PCR-Gemisch auf der Plattform verbleibt. Es ist möglich, den Loader nacheinander erneut auszuführen.
8. Setzen Sie den mit PCR-Gemisch gefüllten Chip-in-a-Tube in den seitlichen Schlitz des Dichtungsverstärkers ein. Drücken Sie auf den Schiebedeckel und die Kante des oberen Deckels, um den Chip nicht zu beschädigen (Abbildung 1B).
9. Lassen Sie den Dichtungsverstärker laufen (ca. 2 Minuten). Lassen Sie den Dichtungsverstärker nacheinander 1 Minute lang erneut laufen, wenn noch eine Flüssigkeitspfütze sichtbar ist, da eine unvollständige Versiegelung eine Kreuzkontamination der positiven Signale verursacht (Abbildungen 1C und 1D).
10. Geben Sie 230 μl Dichtungsflüssigkeit, ein Reagenz auf Ölbasis, in die Rohre.
    Anmerkung: Die Späne sollten nun in die Flüssigkeit eingetaucht werden.
11. Setzen Sie die Schläuche in den Thermocycler ein. Lassen Sie den Thermocycler wie in Tabelle 2 beschrieben laufen (ca. 2 Stunden lang). Passen Sie die Temperatur oder die Dauer der PCR an, wenn es eine ungleichmäßige Verteilung der positiven Partitionen gibt (Abbildung 1E).
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Rampengeschwindigkeit auf ca. 1 °C/s einzustellen.
12. Lassen Sie die Schläuche mindestens 15 Minuten lang im Thermocycler, um das Grundrauschen zu reduzieren.
    Anmerkung: Die Röhren können auch über Nacht stehen gelassen werden. Fluoreszenzsignale wurden auch am nächsten Tag detektiert.
13. Setzen Sie die Röhrchen auf die Detektionsvorrichtung und gießen Sie 6 ml destilliertes Wasser in die Vorrichtung. Wenn Luftblasen innerhalb und außerhalb der Schläuche sichtbar sind, entfernen Sie diese (Abbildungen 1F und 1G).
14. Laden Sie die Vorrichtung in den Detektor und führen Sie sie mit einem Klick auf die Schaltfläche "Ausführen" der Software aus, nachdem Sie die Registerkarten "Fluoreszenz", "Experiment" und "Probe/NTC" (Materialtabelle) ausgewählt haben.
    HINWEIS: Die zweifarbige Erkennung von acht Proben mit einer Standardintensität dauert ca. 4 - 5 Minuten.
15. Bestätigen Sie das Positionsdiagramm, das Histogramm und das 2D-Streudiagramm.
    HINWEIS: Wenn die Fluoreszenzintensität der negativen Partitionen hoch ist, stellen Sie die Intensität mit einem Klick auf die Schaltfläche Einstellungen der Software so ein, dass sie im Bereich von 30–70 liegt.
16. Berechnen Sie die Variantenallelfraktion (VAF) mit der folgenden Formel:
    
    Dabei sind Cv und Cr die Kopienzahlen der Variante bzw. des Referenzallels.
    Anmerkung: Sie werden in der Software automatisch auf Basis der Poisson-Statistik berechnet.

4. Entnahme des PCR-Produkts

1. Entfernen Sie die Dichtungsflüssigkeit aus dem Rohr.
2. Geben Sie 100 μl TE-Puffer in das Röhrchen. 30 s kräftig vortexen und das Röhrchen kurz zentrifugieren.
3. Übertragen Sie die TE-Lösung in ein anderes Röhrchen und fügen Sie 30 μl 3 M Natriumacetat und 200 μl Ethanol hinzu.
4. Die Lösung über Nacht auf -20 °C abkühlen lassen.
5. Die Lösung wird 30 min lang bei 16.000 x g zentrifugiert und der Überstand entfernt.
6. Geben Sie 300 μl 80%iges Ethanol in das Röhrchen und wirbeln
Sie es ein.
7. Die Lösung wird 15 min lang bei 16.000 x g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Den Niederschlag 5 Min. an der Luft trocknen lassen.
8. Lösen Sie den Niederschlag nach dem Trocknen an der Luft in 1–5 μl TE-Puffer auf.
9. Falls erforderlich, ist die Produktgröße mit einem Elektrophoresegerät in Bezug auf Schritt 1 zu bestimmen. Laden Sie 1 μl der Lösung in das Gelgerät, um eine hohe Empfindlichkeit zu erreichen (Materialtabelle).

Ergebnisse

Abbildung 1: Zu beachtende Punkte für den dPCR-Assay im Chip-in-a-Tube-Format.(A) Dieses Panel zeigt, wie der 8-Rohr-Streifen im Autoloader eingerichtet wird. (B) Dieses Panel zeigt gebrochene Chips. (C) Dieses Panel zeigt, wie der Chip unmittelbar nach (i) dem Laden und (ii) dem Versiegeln auftaucht. (iii) Bei unvollständiger Versiegelung ist ein...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
QIAamp DNA Blut Maxi Kit	Qiagen	Artikel-Nr.: 51194	Vor Protokoll 1: Extraktion genomischer DNA
NanoDrop 1000	ThermoFisher WISSENSCHAFTLICH	ND-8000	Vor Protokoll 1: Spektralphotometer
8-Stab-Rohr	Agilent Technologien	401428	Protokoll Nr. 1
Puffer für genomische DNA-Proben	Agilent Technologien	Tel.: 5067-5366	Protokoll Nr. 1:
			Ein Bestandteil des genomischen DNA-Screen-Tape-Assays
DNA-Leiter	Agilent Technologien	Tel.: 5067-5366	Protokoll Nr. 1:
			Ein Bestandteil des genomischen DNA-Screen-Tape-Assays
MS3 Basic Kleiner Schüttler	IKA	Artikel-Nr.: 3617000	Protokoll 1: Vortex-Mischer
Genomische DNA ScreenTape	Agilent Technologien	Tel.: 5067-5365	Protokoll 1: Gel-Gerät
2200 TapeStation-System	Agilent Technologien	G2965AA	Protokoll 1: Elektrophorese-Instrument
TapeStation-Analysesoftware	Agilent Technologien	Im Paket mit G2965AA	Protokoll 1: Analysesoftware
DNA-Oligo-Primer	IDT	Sonderanfertigung	Protokoll Nr. 2
LNA-Sonden	IDT	Sonderanfertigung	Protokoll Nr. 2
Programmentwicklungssystem	IDT	Webseite: http://biophysics.idtdna.com/	Protokoll Nr. 2
dbSNP-Datenbank	NCBI (englisch	Webseite: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/	Protokoll Nr. 2
TE-Puffer	ThermoFisher WISSENSCHAFTLICH	12090015	Protokoll Nr. 3
DNase/RNase-freies destilliertes Wasser	ThermoFisher WISSENSCHAFTLICH	10977015	Protokoll 3 (Tabelle 1)
Clarity Digitale PCR-Sonde Mastermix	JN Medsys	Nr. 12013	Protokoll 3 (Tabelle 1): 2xPCR Mastermix
			Ein Bestandteil von #10011
Clarity Dichtungsflüssigkeit	JN Medsys	Nr. 12005	Protokoll 3: Dichtungsflüssigkeit
			Ein Bestandteil von #10011
Clarity JN-Lösung	JN Medsys	Nr. 12006	Protokoll 3 (Tabelle 1): 20xdPCR-Lösung
			Ein Bestandteil von #10011
Clarity Tube-Strip	JN Medsys	Nr. 12007	Protokoll 3: Chip-in-a-Tube
			Ein Bestandteil von #10011
Clarity Probenladekit	JN Medsys	Nr. 12008	Protokoll 3: Ladefläche und Schieber
			Ein Bestandteil von #10011
Clarity Automatischer Ladevorgang	JN Medsys	Nr. 11002	Protokoll 3: Automatisches Laden
			Ein Bestandteil von #10001
Clarity Sealing Enhancer	JN Medsys	Nr. 11003	Protokoll 3: Dichtungsverstärker
			Ein Bestandteil von #10001
Clarity Reader	JN Medsys	Nr. 11004	Protokoll 3: Lesegerät
			Ein Bestandteil von #10001
Life Eco Thermocycler	Bioer-Technologie	TC-96GHbC	Protokoll 3: Thermocycler
Clarity Software	JN Medsys	Im Bundle mit #10001	Protokoll 3: Analysesoftware
Hochempfindliches D1000 Bildschirmband	Agilent Technologien	Tel.: 5067-5584	Protokoll 4: Gel-Gerät für hohe Empfindlichkeit