1. Qualitätskontrolle der genomischen DNA
HINWEIS: Genomische DNA (gDNA) wurde aus peripherem Blut mit der etablierten DNA-Aufreinigungsmethode auf Basis von Kieselsäuremembranen extrahiert. Im Vorfeld der folgenden Verfahren wurde die Konzentration der gDNA mit einem Spektralphotometer bestimmt.
- Bereiten Sie die gDNA-Probe in einer Konzentration von 10-100 ng/μl vor.
- Geben Sie 10 μl DNA-Probenpuffer in einen 8-Röhrchen-Streifen.
- Geben Sie 1 μl DNA-Leiter oder gDNA in die Röhrchen. Wirbeln Sie die Mischung 1 Minute lang mit dem Mikrotiterplatten-Aufsatz vor.
- Legen Sie das Röhrchen, das Gelgerät und die Pipettenspitzen in das Elektrophoresegerät (Materialtabelle) und starten Sie den Lauf, indem Sie die Start-Taste drücken.
Anmerkung: Das Elektrophoresesystem funktioniert automatisch mit einem Klick auf die Schaltfläche Start.
- Vergewissern Sie sich, dass der im DNA-Probenpuffer enthaltene untere Marker in den Elektropherogrammen korrekt zugeordnet ist. Wenn er falsch zugewiesen ist, weisen Sie den Marker manuell im "Elektroherogramm-Modus" der Software zu.
Anmerkung: Die DNA-Integritätsnummer (DIN) wird automatisch berechnet. Der DIN-Wert ergibt sich aus der DNA-Integrität. Hohe und niedrige DIN-Werte deuten auf eine hochintakte bzw. stark abgebaute gDNA hin.
- Geben Sie die Größenregion der gDNA (> 200 bp) im "Region-Modus" der Software an, um die Konzentration der gDNA (> 200 bp) automatisch zu berechnen.
2. Primer- und Sondendesign
- Berechnen Sie die Werte der Schmelztemperatur (T m) mit einem frei zugänglichen Tool unter den folgenden Bedingungen: 10-25 Basen, 50 mM Na+/K+, 0,80 mM dNTPs und 3 mM Mg2+ (Materialtabelle). Design der Forward- und Reverse-Primer zur Amplifikation der genomischen Region, die Zielallele enthält, mit einemT-m-Wert von etwa 60 °C und einer Amplikonlänge von 100-300 bp.
HINWEIS: Die Konzentration der Oligonukleotide ist in Tabelle 1 aufgeführt.
- Entwerfen Sie die Sonden für gesperrte Nukleinsäuren (LNA) für die Referenz- und Variantenallele basierend auf den folgenden Bedingungen: (i) In jeder Sonde sind 1-6 LNAs vorhanden; ii) ein Fluoreszenzfarbstoff und ein Quencher sind an den 5'- bzw. 3'-Terminus jeder Sonde vorhanden; iii) die Differenz zwischen denT-m-Werten der übereinstimmenden und der nicht übereinstimmenden Sonde beträgt > 10 °C; (iv) DieT-m-Werte der übereinstimmenden und nicht angepassten Sonden sind höher bzw. niedriger als die der Primer [z. B. Forward-Primer: 60,8 °C, Reverse-Primer: 59,8 °C, Referenz-Allel-Sonde (angepasst/nicht angepasst): 62,6/45,3 °C, Varianten-Allel-Sonde (angepasst/nicht angepasst): 61,7/50,5 °C]. DieT-m-Werte wurden mit dem Open-Access-Tool berechnet, das auch für Schritt 2.1 verwendet wurde.
- Stellen Sie sicher, dass die entworfenen Primer und Sonden nicht die Einzelnukleotid-Polymorphismen mit einer Häufigkeit von > 0,1 % umfassen, die aus Datenbanken [z. B. der Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP)] ermittelt wurden.
3. Digitale PCR
- Bereiten Sie die Primer, Sonden und gDNA-Stammlösungen in den in Tabelle 1 beschriebenen Konzentrationen mit einem TE-Puffer vor und lagern Sie sie bei -20–4 °C.
- Mischen Sie die Reagenzien bei Raumtemperatur in einem Gesamtvolumen von 15 μl bis zu einer Endkonzentration, wie in Tabelle 1 beschrieben.
- 3 μl destilliertes Wasser anstelle von gDNA in einer No-Template-Kontrolle (NTC) zugeben.
- Bereiten Sie die 3,5-fache Menge der PCR-Mischung in dreifacher Ausfertigung vor, um den Pipettierfehler zu berücksichtigen.
- Pipettieren Sie die PCR-Mischung auf und ab, um sie zu mischen.
- Setzen Sie die Ladeplattform auf die in der 8-Rohr-Leiste eingebauten Späne und stellen Sie diese auf den Autoloader. Stellen Sie sicher, dass ein Kontakt zwischen dem Span und der Ladefläche besteht.
- Montieren Sie einen Ladeschieber auf der Plattform und halten Sie den Schieber mit dem Stopper vom Lader ab.
- Pipettieren Sie 15 μl des PCR-Gemischs auf der Plattform in der Nähe der Spitze des Schiebers (Abbildung 1A).
- Lassen Sie den Lader laufen, indem Sie den Knopf des Laders drücken (ca. 1 Min.).
Anmerkung: Es ist kein Problem, wenn eine kleine Menge PCR-Gemisch auf der Plattform verbleibt. Es ist möglich, den Loader nacheinander erneut auszuführen.
- Setzen Sie den mit PCR-Gemisch gefüllten Chip-in-a-Tube in den seitlichen Schlitz des Dichtungsverstärkers ein. Drücken Sie auf den Schiebedeckel und die Kante des oberen Deckels, um den Chip nicht zu beschädigen (Abbildung 1B).
- Lassen Sie den Dichtungsverstärker laufen (ca. 2 Minuten). Lassen Sie den Dichtungsverstärker nacheinander 1 Minute lang erneut laufen, wenn noch eine Flüssigkeitspfütze sichtbar ist, da eine unvollständige Versiegelung eine Kreuzkontamination der positiven Signale verursacht (Abbildungen 1C und 1D).
- Geben Sie 230 μl Dichtungsflüssigkeit, ein Reagenz auf Ölbasis, in die Rohre.
Anmerkung: Die Späne sollten nun in die Flüssigkeit eingetaucht werden.
- Setzen Sie die Schläuche in den Thermocycler ein. Lassen Sie den Thermocycler wie in Tabelle 2 beschrieben laufen (ca. 2 Stunden lang). Passen Sie die Temperatur oder die Dauer der PCR an, wenn es eine ungleichmäßige Verteilung der positiven Partitionen gibt (Abbildung 1E).
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Rampengeschwindigkeit auf ca. 1 °C/s einzustellen.
- Lassen Sie die Schläuche mindestens 15 Minuten lang im Thermocycler, um das Grundrauschen zu reduzieren.
Anmerkung: Die Röhren können auch über Nacht stehen gelassen werden. Fluoreszenzsignale wurden auch am nächsten Tag detektiert.
- Setzen Sie die Röhrchen auf die Detektionsvorrichtung und gießen Sie 6 ml destilliertes Wasser in die Vorrichtung. Wenn Luftblasen innerhalb und außerhalb der Schläuche sichtbar sind, entfernen Sie diese (Abbildungen 1F und 1G).
- Laden Sie die Vorrichtung in den Detektor und führen Sie sie mit einem Klick auf die Schaltfläche "Ausführen" der Software aus, nachdem Sie die Registerkarten "Fluoreszenz", "Experiment" und "Probe/NTC" (Materialtabelle) ausgewählt haben.
HINWEIS: Die zweifarbige Erkennung von acht Proben mit einer Standardintensität dauert ca. 4 - 5 Minuten.
- Bestätigen Sie das Positionsdiagramm, das Histogramm und das 2D-Streudiagramm.
HINWEIS: Wenn die Fluoreszenzintensität der negativen Partitionen hoch ist, stellen Sie die Intensität mit einem Klick auf die Schaltfläche Einstellungen der Software so ein, dass sie im Bereich von 30–70 liegt.
- Berechnen Sie die Variantenallelfraktion (VAF) mit der folgenden Formel:
Dabei sind Cv und Cr die Kopienzahlen der Variante bzw. des Referenzallels.
Anmerkung: Sie werden in der Software automatisch auf Basis der Poisson-Statistik berechnet.
4. Entnahme des PCR-Produkts
- Entfernen Sie die Dichtungsflüssigkeit aus dem Rohr.
- Geben Sie 100 μl TE-Puffer in das Röhrchen. 30 s kräftig vortexen und das Röhrchen kurz zentrifugieren.
- Übertragen Sie die TE-Lösung in ein anderes Röhrchen und fügen Sie 30 μl 3 M Natriumacetat und 200 μl Ethanol hinzu.
- Die Lösung über Nacht auf -20 °C abkühlen lassen.
- Die Lösung wird 30 min lang bei 16.000 x g zentrifugiert und der Überstand entfernt.
- Geben Sie 300 μl 80%iges Ethanol in das Röhrchen und wirbeln
Sie es ein.
- Die Lösung wird 15 min lang bei 16.000 x g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Den Niederschlag 5 Min. an der Luft trocknen lassen.
- Lösen Sie den Niederschlag nach dem Trocknen an der Luft in 1–5 μl TE-Puffer auf.
- Falls erforderlich, ist die Produktgröße mit einem Elektrophoresegerät in Bezug auf Schritt 1 zu bestimmen. Laden Sie 1 μl der Lösung in das Gelgerät, um eine hohe Empfindlichkeit zu erreichen (Materialtabelle).
