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Alle Eingriffe mit menschlichen Teilnehmern wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.
HINWEIS: Dieses Verfahren wurde speziell für den Nachweis einer geringen Anzahl von cDNA-Molekülen in menschlichem, frisch gefrorenem Gewebe entwickelt. Die Gewebeschnitte wurden auf Trockeneis geschnitten, während sie noch gefroren waren, aus zuvor validierten patienteneigenen Magentumor- oder normalen Gewebeproben.
1. RNA-Isolierung und -Reinigung
- RNA-Extraktion
Anmerkung: Die RNA-Isolierung erfolgt unter der Haube mit einem speziellen Produkt (siehe Materialtabelle). Es ist jedoch eine Vielzahl von Isolationskits im Handel erhältlich.
- 50 - 100 mg einer fein geschnittenen, frisch gefrorenen Gewebeprobe in einem 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL des RNA-Isolationsreagenzes homogenisieren und 15 s lang kräftig vortexen. Die Röhrchen über Nacht bei -80 °C inkubieren.
- Das Röhrchen mit der Probe wird 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und 15 s lang durch Vortexen gemischt.
- Halten Sie das Röhrchen auf Eis, fügen Sie 200 μl Chloroform hinzu und wirbeln Sie es 15 s lang kräftig auf.
- Die Röhrchen werden bei Raumtemperatur 60 s inkubiert und bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Die wässrige Phase wird in ein 1,5-ml-Röhrchen überführt und 20 μg Glykogen zugegeben.
Anmerkung: Es ist wichtig, die Übertragung von Interphasen- oder organischen Schichten sorgfältig zu vermeiden, um Kontaminationen zu reduzieren.
- Fügen Sie 500 μl Isopropanol hinzu, drehen Sie das Röhrchen zum Mischen um und inkubieren Sie es 10 Minuten lang auf Eis.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C, um RNA.
Anmerkung: Die RNA befindet sich in einem gelartigen Pellet an der Seite und am Boden des Röhrchens, das nach der Zentrifugation oft unsichtbar ist.
- Entfernen Sie den Überstand, ohne den Niederschlag zu stören, und waschen Sie ihn durch Pipettieren mit 1 ml 75%igem Ethanol.
- Das Röhrchen bei 7.500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören.
- Lassen Sie das Pellet trocknen, bis der Niederschlag transparent wird, und lösen Sie es in 50 μl RNase-freiem Wasser auf.
- Frieren Sie die Proben vor der Quantifizierung mindestens über Nacht bei -80 °C ein.
- Genomische DNA-Eliminierung und RNA-Aufreinigung
Anmerkung: Für die Analyse von Zielen mit geringer Abundanz wird ein DNase-Verdauungsschritt empfohlen, gefolgt von einer säulenbasierten RNA-Aufreinigung, um kontaminierende DNA zu verdauen.
- Die lyophilisierte DNase I (1.500 Kunitz-Einheiten) wird mit einer Spritze in 550 μl RNase-freiem Wasser aufgelöst, durch Umdrehen des Fläschchens vorsichtig gemischt und die rekonstituierte Stammlösung in Aliquote aufgeteilt.
- Das berechnete Volumen der Probe mit 15 μg RNA, 10 μl DNase-Aufschlusspuffer aus dem Kit (in der Materialtabelle aufgeführt), 2,5 μl DNase-I-Stammlösung und RNase-freiem Wasser in ein 1,5-ml-Röhrchen überführen und 10 μl bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie 350 μl Gewebelysepuffer (aus dem Kit, siehe Materialtabelle) hinzu und mischen Sie durch Pipettieren.
- 250 μl 100 % Ethanol zugeben und durch Pipettieren mischen.
- Das gesamte Volumen (700 μL) wird in eine neue Spin-Säule überführt und bei 12.000 x g für 15 s zentrifugiert.
- Den Filter in ein neues Sammelröhrchen umfüllen, 500 μl 80 % Ethanol in die Säule geben und 2 Minuten lang bei 12.000 x g zentrifugieren.
- Öffnen Sie den Deckel der Spin-Säule und zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 5 Minuten mit einem neuen Auffangröhrchen, um den Filter zu trocknen; dann geben Sie den Filter in ein 1,5-ml-Röhrchen.
- Geben Sie 14 μL RNase-freies Wasser direkt in die Filtersäule und zentrifugieren Sie 1 min lang bei 12.000 x g.
- Bewahren Sie die Proben auf Eis auf und fahren Sie mit der Quantifizierung mit 2 μl der Probe auf einem Tischspektrophotometer fort oder lagern Sie die RNA bis zur Verwendung bei -80 °C.
2. Einrichtung der digitalen PCR-Reaktion
- dPCR-Reaktionsmischung und Probenvorbereitung
- Tauen Sie den Mastermix und den Assay mindestens 20 Minuten lang bei Raumtemperatur auf.
- Die cDNA-Proben werden auf eine Konzentration von 300 ng in 6 μl Wasser verdünnt.
- Bereiten Sie den Mastermix vorsichtig vor und bereiten Sie den Mix in einem sterilen Röhrchen mit 8,7 μl Mastermix, 0,87 μl des speziell entwickelten Assay-Primers CDH1a und 1,83 μl nukleasefreiem Wasser für ein Endvolumen von 11,4 μl.
Anmerkung: Einzelheiten zu den speziell entwickelten Assay-Primern von CDH1a finden Sie in der Materialtabelle.
- 11,4 μl der vorbereiteten Mischung in die verdünnte cDNA-Probe überführen, vorsichtig mischen und kurz zentrifugieren.
Anmerkung: Das Volumen enthält 20 % Überschuss, um den Volumenverlust durch das Pipettieren auszugleichen. Bereiten Sie den Mix für alle Samples und eine No Template Control (NTC) vor.
- Spänevorbereitung
Hinweis: Für ein optimales Ergebnis laden Sie die Chips so schnell wie möglich.
- Schließen Sie den Spänelader an und warten Sie, bis die Kontrollleuchte grün leuchtet.
- Entfernen Sie die Kappe der Tauchflüssigkeitsspritze, indem Sie den Kolben vorsichtig 1 - 2 mm zurückziehen und loslassen, um diesen Schritt zu erleichtern, und ersetzen Sie ihn durch eine Spitze.
- Nehmen Sie einen neuen Chip, und notieren Sie sich den auf dem Deckel geschriebenen Code, um ihn mit der Probe zu verknüpfen.
- Halten Sie den Deckel vorsichtig an die Seite, ziehen Sie die Schutzfolie ab und legen Sie den Deckel mit der klebrigen Vorderseite nach oben in die richtige Ausrichtung.
- Nehmen Sie vorsichtig einen Span auf, achten Sie darauf, das Innenteil nicht zu berühren, und laden Sie ihn in der richtigen Position auf das Spänenest, indem Sie den Hebel nach unten drücken, um die Klemme zu öffnen.
- Laden Sie ein neues Ladeschild auf den Lader und schieben Sie es vorsichtig an, um sicherzustellen, dass es fest sitzt.
- Übertragen Sie 14,5 μl des dPCR-Reaktionsgemisches auf die Ladeklinge, ohne Luftblasen zu bilden oder die Klinge abzulenken, und drücken Sie anschließend die schwarze Ladetaste, um das Volumen auf dem Chip zu verteilen.
- Mit der Immersionsflüssigkeitsspritze ca. 20 Tropfen auf die Chipoberfläche geben und dabei darauf achten, dass die Oberfläche nicht mit der Spitze berührt wird.
Anmerkung: Es ist wichtig, die gesamte Oberfläche abzudecken, ohne Flüssigkeit über die Ränder zu verschütten.
- Drehen Sie den Ladearm so, dass der Deckel mit dem Chip in Berührung kommt, und drücken Sie ihn 15 s lang nach unten.
- Drücken Sie die Deckeltaste, um den Chip freizugeben und den Arm wieder in seine Position zu bringen.
- Halten Sie den zusammengebauten Chip in einem Winkel von 45° und geben Sie die Tauchflüssigkeit vorsichtig mit der Spritze durch die Einfüllöffnung, drehen Sie den Chip leicht, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind, und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem sterilen Tuch.
- Verschließen Sie das Chipgehäuse, indem Sie das Etikett auf dem Chipdeckel vorsichtig abziehen und mindestens 5 s lang über die Einfüllöffnung drücken.
- Lagern Sie den Chip im Dunkeln, bis er in den Thermocycler geladen werden kann.
Anmerkung: Vorbereitete Chips sollten innerhalb von 2 h verwendet werden.
- dPCR-Reaktion
- Öffnen Sie den Deckel und installieren Sie die Adapter an beiden Blöcken, auch wenn ein einzelner Block verwendet wird.
- Platzieren Sie die Späne in der richtigen Position auf dem Probenblock.
Anmerkung: Die Einfüllöffnung muss in erhöhter Position zur Vorderseite des Thermocyclers ausgerichtet sein, damit Luftblasen nach oben schwimmen können, ohne das Fenster des Chips zu stören. Verwende leere Chips, um die beiden Blöcke auszubalancieren.
- Legen Sie das Wärmeleitpad auf den Probenblock, um die Späne vollständig zu bedecken.
- Schließen Sie den Deckel und starten Sie den PCR-Lauf unter folgenden Bedingungen: 10 Minuten lang bei 96 °C halten; 45 Zyklen bei 60 °C für 2 Minuten und 98 ΰC für 30 s; 2 Minuten lang bei 60 °C halten; bei 4 ΰC halten. Den Thermocycler ausschalten und die Chips mindestens 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auftauen
Anmerkung: Die Chipanalyse muss innerhalb einer Stunde durchgeführt werden.
- Chip-Analyse
- Öffnen Sie den Deckel des Geräts, entfernen Sie die Wärmeleitpads, dann entfernen Sie die Chips von den Adaptern.
Anmerkung: Lagern Sie die Chips bis zur Analyse an einem dunklen, sauberen Ort.
- Reinigen Sie die Chipoberfläche mit Isopropanol und einem sterilen Tuch.
Anmerkung: Überprüfen Sie jeden Chip auf Lecks oder potenzielle Probleme.
- Stecken Sie den USB-Stick in das Detektorsystem, um die Daten zu speichern.
- Öffnen Sie die Chip-Schublade des Detektorsystems, legen Sie den Chip mit der bedruckten Seite nach oben in die richtige Position ein und schließen Sie die Kassette.
- Warten Sie 30 s auf die Verarbeitung, entfernen Sie dann den Chip und setzen Sie den nächsten Chip ein.
- Warten Sie, bis die Analyse für alle verarbeiteten Chips abgeschlossen ist, und schließen Sie dann den USB-Stick an einen Computer an, um die Dateien zu übertragen.
Anmerkung: Die Gesamtzeit für die Analyse beträgt ca. 2 bis 3 min/Chip.
3. Datenanalyse und -interpretation
- Verbinden Sie sich mit der Cloud-basierten Softwareplattform, die für die Durchführung aller nachgelagerten Analysen erforderlich ist.
- Erstellen Sie ein Projekt und importieren Sie alle Datendateien der gewünschten Chips.
- Geben Sie den Namen der Probe ein und wählen Sie den verwendeten Farbstoff und Assay auf der Registerkarte "Chips definieren" aus.
- Stellen Sie fest, ob der Chip akzeptabel ist, indem Sie ihn auf der Registerkarte "Daten überprüfen" visualisieren und überprüfen, wie gründlich die Probe auf den Chip geladen wurde und wie viele Datenpunkte auswertbar sind.
Anmerkung: Lehnen Sie Chips mit weniger als 13.000 auswertbaren Datenpunkten ab.
- Fahren Sie mit dem Streudiagramm des ausgewählten Chips auf der rechten Seite des Bildschirms fort. Wenden Sie einen Schwellenwert von 6.000 für die Reporterfarbstoffsignale des Fluorescein Amidit (FAM) (Y-Achse) auf alle Chips an.
Anmerkung: Die Festlegung des Schwellenwerts kann je nach verwendetem Assay variieren.
- Entfernen Sie alle zweifelhaften positiven Signale, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden, indem Sie den relativen Punkt im Streudiagramm mit dem Lasso-Werkzeug auswählen und auf "unbestimmt" drücken. Alle verbleibenden positiven Spots weisen auf das Vorhandensein von cDNA-Kopien des analysierten seltenen Ziels hin.