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HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten rekombinanten Proteine Hsp90 und Cdc37 wurden kommerziell erhalten (siehe Materialtabelle).
1. Chip-Aktivierung
HINWEIS: Alle Materialien, die im Experiment verwendet werden sollen, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Alle vorbereiteten Lösungen werden durch einen sterilen 0,2 μm Filter filtriert.
- Bereiten Sie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)-Lösung vor, indem Sie 2 mg EDC zu 2,5 ml 1 M 2-(N-morpholino) ethansulfonsäure (MES)-Puffer (pH = 6,0) in einem 15-ml-Röhrchen hinzufügen. Bereiten Sie N-Hydroxysulfosuccinimid-Lösungen (Sulfo-NHS) vor, indem Sie 6 mg Sulfo-NHS zu 2,5 ml 1 M MES-Puffer (pH = 6,0) in einem separaten 15-ml-Röhrchen hinzufügen. Aliquotieren Sie 50 μl jeder Lösung in unabhängigen Röhrchen und lagern Sie sie für die zukünftige Verwendung bei -20 °C.
- Mischen Sie gleiche Volumina EDC und Sulfo-NHS-Lösung (50 μl EDC + 50 μl Sulfo-NHS), indem Sie auf und ab pipettieren (nicht vortexen).
HINWEIS: Die gemischte Lösung von EDC/Sulfo-NHS muss innerhalb von 30 Minuten verwendet werden, um eine effektive Vernetzung für eine ordnungsgemäße Chipfunktionalisierung aufrechtzuerhalten.
- Legen Sie den vom Unternehmen gelieferten Biosensor-Chip (5,7 cm x 2,4 cm; siehe Materialtabelle) in eine Petrischale aus Glas mit aufgesetztem Deckel. Es wird empfohlen, alle Funktionalisierungsschritte, die an der Chipaktivierung beteiligt sind, in der Petrischale durchzuführen. Geben Sie 50 μl 1 M MES-Puffer (pH = 6,0) auf den Biosensorchip, inkubieren Sie ihn 1 Minute lang bei Raumtemperatur und aspirieren Sie dann den Puffer.
- 50 μl EDC/Sulfo-NHS-Lösung sofort auf den Sensorchip auftragen. Die Petrischale abdecken und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. EDC/Sulfo-NHS-Lösung aus dem Chip aspirieren.
- Spülen Sie den Chip einmal mit 50 μl 1 M MES-Puffer (pH = 6,0) und aspirieren Sie den MES-Puffer.
2. Immobilisierung des Zielproteins
- Spülen Sie den Chip 2x mit 50 μL 1x PBS (pH = 7,4). Aspirieren Sie das PBS aus dem Chip und fügen Sie das Zielmolekül Hsp90 (50 μL; 500 nM) hinzu.
HINWEIS: Eine Pufferfehlanpassung kann das gesamte Experiment ruinieren. Daher ist es wichtig, vor dem Experiment sicherzustellen, dass sich das Zielmolekül im selben Puffer befindet, der für die Kalibrierung verwendet wird (z. B. 1x PBS (pH = 7,4)). Falls erforderlich, führen Sie vor dem Experiment einen Pufferaustausch durch Nachtdialyse durch. In diesem Experiment wurde eine Übernachtdialyse für beide rekombinanten Proteine, Hsp90 und Cdc37, gegen 1x PBS (pH = 7,4; siehe Materialtabelle) mit korrektem Pufferaustausch bei 4 °C durchgeführt. Die Konzentration des Zielmaterials (in diesem Fall Hsp90) kann je nach verschiedenen experimentellen Protokollen und der Art der Zielmaterialien (Protein/Peptid/Liganden) variieren.
- Decken Sie die Petrischale aus Glas ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Lösung, die das Zielmolekül enthält, aspirieren und 3x mit 50 μl 1x PBS spülen (pH = 7,4). Aspirieren Sie die 1x PBS (pH = 7,4) Lösung aus dem Chip.
- Geben Sie 50 μl Quench 1 (3,9 mM Amino-PEG5-Alkohol in 1x PBS (pH = 7,4)) Lösung in den Chip. Decken Sie die Petrischale aus Glas ab und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Lösung Quench 1 wird aus dem Chip abgesaugt.
- Geben Sie 50 μl Quench 2 (1 M Ethanolamin (pH = 8,5)) Lösung in den Chip. Decken Sie die Petrischale aus Glas ab und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie Quench 2-Lösung aus dem Chip und spülen Sie den Chip 5x mit 50 μl 1x PBS aus, wobei Sie das letzte PBS-Tröpfchen auf dem Sensor belassen.
3. Vorbereitung von Analytproben
- Bereiten Sie die Analytverdünnungsreihe für Cdc37 im gewünschten Konzentrationsbereich vor. Für das erste Experiment wurden die folgenden Konzentrationen verwendet: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM und 5.000 nM. Für das zweite Experiment wurde ein anderer Satz von Konzentrationen im Bereich von 0,4 nM bis 200 nM verwendet.
- Entwerfen Sie das Experiment so, dass es mindestens acht verschiedene Analytkonzentrationen umfasst, um einen zuverlässigen KD-Wert zu erhalten. Bereiten Sie die verschiedenen Verdünnungen des Analytproteins in demselben Puffer vor, der für die Kalibrierung und das Zielprotein verwendet wird. hier ist es 1x PBS (pH = 7,4).
4. Laden des aktivierten Biosensor-Chips in das FEB-Gerät
HINWEIS: Das FEB-Gerät besteht aus einem Lesegerät mit LED-Lichtanzeigen und einer Kartusche zum Einsetzen des Biosensorchips.
- Nach der Immobilisierung des Zielproteins wird der aktivierte Chip in die Kartusche des Geräts eingesetzt, die über USB mit einem Computer verbunden ist. Nach dem Einsetzen des Chips leuchtet eine grüne LED auf dem Lesegerät auf, die anzeigt, dass das FEB-Gerät für das Experiment bereit ist. Installieren Sie die von der Firma gelieferte automatisierte Software (siehe Materialtabelle) auf dem Computer, an den das FEB-Gerät angeschlossen ist, um das Experiment Schritt für Schritt zu überwachen, wie unten beschrieben.
5. Führen Sie das Experiment durch
- Drücken Sie auf das Modul Run Experiment in der automatisierten Software und wählen Sie 10 Points with Regeneration oder ein anderes gewünschtes Protokoll. Geben Sie die folgenden Details ein: Name des Operators, Name des Experiments, Datum (z. B. Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); Regenerationspuffer (z. B. PBS-Puffer); das immobilisierte Ziel (z. B. Hsp90); Analyt in Lösung (z. B. Cdc37).
- Drücken Sie die Schaltfläche Begin the Experiment, die in der Software angezeigt wird, und befolgen Sie die Anweisungen der automatisierten Software, wie unten beschrieben.
Anmerkung: Die Software ist vollautomatisiert, benutzerfreundlich und führt den Benutzer Schritt für Schritt durch das Experiment. Auf dem Bildschirm erscheint ein Popup-Fenster mit Anweisungen, wie Sie bei jedem Schritt des Experiments fortfahren können. Die Software stellt Anweisungen für jeden sich wiederholenden Schritt nacheinander bereit, von der Kalibrierung über die Analytassoziation, die Dissoziation, die Regeneration bis hin zum Waschen (5x) für jede Analytkonzentration während des gesamten Experiments.
- Führen Sie die Kalibrierung des Geräts durch. Aspirieren Sie dazu die restliche PBS-Lösung aus dem Chip und tragen Sie 50 μl Kalibrierpuffer (1x PBS; pH = 7,4) auf. Drücken Sie die Schaltfläche Weiter und warten Sie 5 Minuten, bis der Kalibrierungsschritt abgeschlossen ist. Die Software zeigt den für den Kalibrierungsschritt (5 Minuten) ermittelten Endpunkt mit einem Warnalarm zur Nachverfolgung an.
- Führen Sie als Nächstes eine Analyt-Assoziation durch. Aspirieren Sie dazu den Kalibrierpuffer vom Chip und tragen Sie 50 μl der niedrigsten Analytkonzentration (25 nM von Cdc37) auf. Drücken Sie die Schaltfläche Weiter und warten Sie 5 Minuten, bis der Zuordnungsschritt abgeschlossen ist. Die Software zeigt den Endpunkt für den Zuordnungsschritt (5 Minuten) mit einem Warnalarm an, um fortzufahren.
- Führen Sie eine Analytdissoziation durch. Aspirieren Sie dazu die Analytlösung aus dem Chip und tragen Sie 50 μl des Dissoziationspuffers (1x PBS; pH = 7,4) auf. Drücken Sie die Schaltfläche Weiter und warten Sie 5 Minuten, bis die Dauer des Dissoziationsschritts (5 Minuten) abgeschlossen ist. Die Software zeigt den Endpunkt für den Dissoziationsschritt (5 Minuten) mit einem Warnalarm zur Nachverfolgung an.
- Führen Sie als Nächstes die Chip-Regeneration durch. Die Dissoziationslösung wird vom Chip abgesaugt und 50 μl Regenerationspuffer (1x PBS; pH = 7,4) aufgetragen. Drücken Sie die Schaltfläche Weiter und warten Sie 30 s, bis die Dauer des Regenerationsschritts (30 s) abgeschlossen ist. Die Software zeigt den Endpunkt für den Regenerationsschritt (30 s) mit einem Warnalarm zur Nachverfolgung an.
- Zum Schluss den Chip waschen. Aspirieren Sie die Regenerationslösung aus dem Chip und tragen Sie 50 μl Waschpuffer (1x PBS; pH = 7,4) auf den Chip auf. Saugen Sie die Lösung aus dem Chip ab und wiederholen Sie dies 5x. Lassen Sie den letzten Tropfen Waschpuffer auf dem Chip, drücken Sie die Schaltfläche Weiter und warten Sie 30 s, bis die Dauer des Waschschritts in der Softwareanzeige beendet ist.
HINWEIS: Die Software zeigt den Endpunkt für den Waschschritt (30 s) mit einem Warnalarm an, um mit dem nächsten Zyklus des Experiments fortzufahren.
- Wiederholen Sie die Schritte für jede verwendete Analytkonzentration; die fünf Schritte Kalibrierung, Analytassoziation, Dissoziation, Regeneration und Waschen (5x) bilden einen Zyklus. Für das hier gezeigte Experiment führten wir 10 Zyklen für 10 Analytkonzentrationen durch (im Bereich von 25 nM bis 5.000 nM oder 0,4 nM bis 200 nM; Abbildung 1).
