Techniken zum Nachweis biomolekularer Interaktionen

In diesem Video beschreiben wir die Field-Effect-Biosensing-Technologie (FEB) zum Nachweis und zur Quantifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Die auf dem Graphen-Biosensor immobilisierten Zielproteine interagieren mit Analytproteinen in Lösung, was zu elektrischen Stromänderungen im FEB-System führt. Diese Änderung der elektrischen Reaktion deutet auf die Bindungsaffinität zwischen den Proteinen hin.

In diesem Video demonstrieren wir die Verwendung von Massenphotometrie zur Untersuchung von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen in einer Durchflusskammer. Das gebündelte Licht streut je nach Masse der Moleküle unterschiedlich. Ein Detektor sammelt das Streulicht und erzeugt das Interferenzmuster in Form von Flecken unterschiedlicher Intensität, die mit den Molekülmassen korrelieren.

Das Video beschreibt die FLIM-FRET-Bildgebungstechnik zur Bestimmung der Protein-Protein-Interaktion in lebenden Bakterien, die zytoplasmatische Proteine exprimieren, die mit fluoreszierenden Proteinen, einem Donor-eGFP und einem Akzeptor mCherry markiert sind. Die kombinierte Technik ermöglicht auch die Quantifizierung der interagierenden Proteine.

In diesem Video demonstrieren wir die Technik zur Messung transzellulärer Wechselwirkungen zwischen synaptischen Zelladhäsionsmolekülen durch den HEK-Zellaggregationsassay. In diesem Assay wird eine gleiche Anzahl von HEK-Zellen, die ein gewünschtes präsynaptisches Zelladhäsionsmolekül exprimieren, und ein fluoreszierendes Protein mit HEK-Zellen gemischt, die ein postsynaptisches Zelladhäsionsmolekül und ein weiteres fluoreszierendes Protein exprimieren. Die Wechselwirkung zwischen den...

Dieses Video beschreibt den Proximity-Ligation-Assay zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Nematodenzellen. Die unmittelbare Nähe der interessierenden Proteine erzeugt das zirkuläre DNA-Template mit Hilfe einer PLA-Sonde, die an einen Sekundärantikörper gebunden ist. Die Sonde wird mit der Amplifikationslösung weiter amplifiziert, die eine lange einzelsträngige DNA erzeugt, gefolgt von der Hybridisierung der Detektorsonde, die die Lokalisierung von...

Dieses Video zeigt co-immunpräzipitierte Proteinkomplexe auf einer PVDF-Membran für die Protein-Protein-Interaktionsanalyse. Die reduzierten Proteine aus den Komplexen wurden mit Trypsin behandelt, um die einzelnen Proteine an den kleineren Peptiden zu spalten, dann wurden die restlichen Peptide aus der PVDF-Membran extrahiert. Das gezogene Peptid, das von beiden Proteinen in dem Komplex abgeleitet war, wurde dann getrocknet und in einer niedrigen Konzentration von Ameisensäure für die weitere...

In diesem Video demonstrieren wir die Biolayer-Interferometrie (BLI)-Technologie, um die intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Liganden und Zielanalyten in Echtzeit zu detektieren. BLI misst Veränderungen im Interferenzmuster von weißem Licht, das von einer Schicht immobilisierter Liganden auf einer Biosensoroberfläche reflektiert wird, wenn sie mit Analyten in Lösung interagieren.

Dieses Video zeigt die Verwendung von Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie, um die Wechselwirkung zwischen Zelloberflächenproteinen bei Zell-Zell-Kontakten zu detektieren. Durch die Expression des interessierenden Transmembran-Adhäsionsrezeptors, der mit einem fluoreszierenden Protein markiert ist, und durch Mischen von zwei verschiedenen Zellpopulationen, die zwei spektral getrennte Fluoreszenzmarkierungen besitzen, wird die Trans-Interaktion zwischen den Rezeptoren zweier benachbarter Zellen...

In diesem Video demonstrieren wir eine Technik zur Durchführung der Co-Immunpräzipitation von GFP-markierten Wildtyp- und mutierten PD-1-Proteinen unter Verwendung von Kügelchen, die mit Anti-GFP-Antikörpern beschichtet sind. Die beadgebundenen PD-1-GFP-Proteine werden mit SHP2-Proteinen inkubiert, die mit PD-1 interagieren, was die Identifizierung spezifischer Strukturmotive in PD-1 ermöglicht, die eine entscheidende Rolle bei der SHP2-Interaktion spielen.

Dieses Video beschreibt eine ELISA-basierte Technik, die Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen erkennt, indem die Bindung des zweiten Proteins an das immobilisierte erste Protein gemessen wird. Das gebundene zweite Protein wird mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen, die mit einem Enzym markiert sind, wie z. B. Meerrettichperoxidase.

Dieses Video zeigt einen konduktimetrischen Biosensor-Assay, um die Interaktion eines Antikörpers mit einem Zielantigen zu untersuchen, das auf einem Schallkopfchip immobilisiert ist. Der Biosensor ist so konstruiert, dass er ein bifunktionelles chimäres Protein enthält – ein β-Lactamase-Enzym mit einer funktionellen katalytischen Stelle, die mit einem Nanobody fusioniert ist, um an das immobilisierte Zielantigen zu binden. Bei der Bindung erzeugt die katalytische Hydrolyse eines...

Dieses Video zeigt eine Technik, die biotinylierte zellpenetrierende Peptide verwendet, um intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen. Die zellpenetrierenden Peptide erleichtern es dem konjugierten Peptid, in eine Zelle einzudringen und spezifisch an seine interagierenden Proteine zu binden. Das Biotin ermöglicht nach der Bindung an Avidin die Reinigung des Komplexes der interagierenden Proteine aus einem Zelllysat.

Dieses Video zeigt den Hefe-Zwei-Hybrid-Assay zum Nachweis spezifischer Protein-Selbstinteraktionen. In diesem Assay wird das Protein von Interesse an zwei Domänen eines Transkriptionsfaktors gebunden, der für das β-Galactosidase-Enzym kodiert. Wenn die beiden Proteine interagieren, bewirkt dies, dass Transkription und Translation das Enzym bilden, das dann mit einem biochemischen Assay nachgewiesen wird.

Dieses Video demonstriert die Tandem-Affinitätsreinigung — eine Technik zur Reinigung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen, um die Protein-Protein-Interaktion zu untersuchen. Der Komplex enthält zwei Proteine, die mit unterschiedlichen Epitop-Tags markiert sind. Nach der Reinigung des Komplexes unter Verwendung von zwei Harzen mit einer Affinität für die beiden verschiedenen Tags in einer sequentiellen Weise bestätigt das Vorhandensein beider Proteine in der Eluierung die...

Dieses Video beschreibt die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) Technik zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen mit Hilfe eines Sensorchips. Die Änderung des Resonanzwinkels und die Intensität des reflektierten Lichts werden als Funktion der Assoziation und Dissoziation zweier Moleküle detektiert, was Aufschluss über die Wechselwirkungen zwischen den beiden Molekülen gibt.

Dieses Video beschreibt die Kernspinresonanzspektroskopie-Technik zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen 15N-markierten Wildtyp- und mutierten Envoplakin-Proteinen und dem unmarkierten Vimentin-Protein. Die erfolgreiche Interaktion zwischen Wildtyp-Envoplakin und Vimentin führt zu einer großflächigen Linienverbreiterung und zum Verschwinden von Peaks in den NMR-Spektren, während das Fehlen einer Wechselwirkung zwischen dem mutierten Envoplakin und Vimentin zu gut...

In diesem Video demonstrieren wir die Phagen-Display-Technik, um vorgefertigte Phagen zu isolieren, die Proteine mit hoher Affinität zum Zielprotein exprimieren.

Dieses Video demonstriert die Technik der Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie (FFS) zur Untersuchung der Homo-Oligomerisierung von Proteinen. Fluoreszenzmarkierte Proteine in einer Probe werden bei der Untersuchung der Proteinoligomerisierung mit FFS mit einem Wirkstoff dimerisiert. Während sich die Proteine in das kleine Beobachtungsvolumen hinein- und herausbewegen, wird mit einem konfokalen Mikroskop die Analyse der Helligkeitsschwankungen der fluoreszierenden Moleküle durchgeführt, um den...

Dieses Video beschreibt BiFC-PALM ― eine Kombination aus photoaktivierter Lokalisationsmikroskopie und bimolekularer Fluoreszenzkomplementierung ― zur Beurteilung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. BiFC beinhaltet die Fusion von zwei fluoreszierenden Proteinfragmenten mit zwei interagierenden Proteinen von Interesse. Wenn die beiden Proteine interagieren, werden die Fragmente in die Nähe gebracht, wodurch die beiden Teile zusammenkommen und ein funktionsfähiges fluoreszierendes Protein...

In diesem Video beschreiben wir die Fluoreszenz-Anisotropie-Technik, um die Wechselwirkungen zwischen dem Fluorophor-markierten Shwachman-Diamant-Syndrom (SBDS)-Protein und der Elongationsfaktor-ähnlichen 1 GTPase (EFL1) zu untersuchen. Bei der Inkubation von SBDS-Proteinen mit allmählich steigenden Konzentrationen von EFL1 wird ein stetiger Anstieg der Anisotropie beobachtet, was auf eine erfolgreiche Interaktion zwischen den beiden Proteinen hinweist.

In diesem Video demonstrieren wir die In-Zell-Kernspinresonanzspektroskopie-Technik, um Protein-Liganden-Wechselwirkungen zwischen unmarkierten, überexprimierten Proteinen und kleinen Molekülen zu untersuchen. Die erfolgreiche Liganden-Protein-Wechselwirkung wird visuell durch das Auftreten eines zusätzlichen Satzes von Peaks im interessierenden Spektralbereich bestätigt, der die ursprünglichen Peaks allmählich ersetzt.

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Untersuchung von Protein-Wirkstoff-Wechselwirkungen unter Verwendung von QCM-Biosensor-basiertem Biopanning der T7-Phagen-displayed Peptid-Bibliothek. Das Biopanning von Phagen, die ein spezifisches Peptid auf dem QCM-Biosensor aufweisen, ermöglicht die spezifische Isolierung von hochaffinen Peptiden, gefolgt von einer Aminosäuresequenzierung, die hilft, spezifische Interaktionsstellen auf dem Zielprotein zu identifizieren.

Dieses Video beschreibt SEC-MALS, das die Fähigkeiten der Größenausschlusschromatographie (SEC) und der Mehrwinkellichtstreuung (MALS) nutzt. Bei SEC-MALS trennt der SEC Proteine oder Proteinkomplexe anhand ihrer Größe, und der MALS-Detektor bestimmt das durchschnittliche Molekulargewicht, indem er die Intensität des vom Molekül in verschiedenen Winkeln gestreuten Lichts misst.

In diesem Video haben wir die bimolekulare Komplementationsaffinitätsreinigung (BiCAP) demonstriert, um spezifische Proteindimere unter Verwendung von konformationsspezifischen Einzeldomänen-Antikörpern nachzuweisen und zu isolieren.

In diesem Video beschreiben wir einen auf Durchflusszytometrie basierenden kompetitiven Bindungsassay, um die Wechselwirkungen zwischen dem CXC-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4) und seinem fluoreszenzmarkierten natürlichen Liganden CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12) in Gegenwart eines auf CXCR4 abzielenden kleinen Moleküls nachzuweisen. Die Inkubation von CXCR4-exprimierenden Zellen mit niedrigeren Konzentrationen kleiner Moleküle ermöglicht bis zu einem gewissen Grad die Bindung von CXCR4-CXCL12, die...

Dieses Video zeigt die auf Reporter-Assays basierende Detektion der Rezeptor-Liganden-Interaktion. Die erfolgreiche Rezeptor-Liganden-Interaktion aktiviert den nachgeschalteten Signalweg und bewirkt die Bildung und Freisetzung von Zytokinen als sekretorische Reportermoleküle in der Lösung, was mit ELISA bestätigt wird.

In diesem Video werden Biomembran-Kraftsonden (BFPs) verwendet, um die Kräfte zwischen Rezeptoren und Liganden zu messen. Diese Technik kann Wechselwirkungen erkennen, indem der Druck überwacht wird, der erforderlich ist, um die Bindungen zwischen dem pMHC, das auf den Sondenkügelchen konjugiert ist, und den TCRs auf den Zielzellen aufzubrechen.

Dieses Video zeigt einen Wettbewerbsassay zur Untersuchung von GTPase-bindenden Proteinpartnern. Unter Verwendung von nukleotidgebundenem GTPase-Protein, das auf magnetischen Beads immobilisiert ist, kann die kompetitive Bindung zwischen zwei interagierenden Proteinpartnern für dieselbe Bindungsstelle auf der GTPase untersucht werden, um die Bindungsaffinitäten der Proteinpartner zu beurteilen.

In diesem Video demonstrieren wir den Prozess zum Nachweis von Antikörper-Isotypen in mehreren menschlichen Serumproben anhand eines Microarray-Objektträgers, der mit antigenen Subtypen von Influenzavirusstämmen gedruckt wurde.

In diesem Video demonstrieren wir den elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassay zum Nachweis von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Infrarot-Fluoreszenz-markierten DNA-Sonden. Wenn das Protein an die DNA-Sonde bindet, bildet es einen großen Komplex, der langsam weiterwandert und als verschobene Bande auf dem Gel erscheint.

In diesem Video demonstrieren wir die Chromatin-Immunpräzipitationstechnik zur Identifizierung von Proteinbindungsstellen an spezifischen Regionen der genomischen DNA von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch die selektive Immunpräzipitation von proteingebundenen Chromatinfragmenten. Diese Methode hilft, das Zusammenspiel mehrerer regulatorischer Proteine zu untersuchen, einschließlich Transkriptionsfaktoren, die an der Genregulation beteiligt sind.

Dieses Video beschreibt eine Hochleistungs-Fluoreszenzanisotropie, die hilft, die Interaktion zwischen Transkriptionsfaktoren und DNA zu überwachen. Der Assay überwacht die Wechselwirkungen eines Fluorophor-markierten DNA-Moleküls mit seinem spezifischen Transkriptionsfaktor, indem er den Polarisationsgrad aufgrund der molekularen Rotation oder Anisotropie der Fluorophor-markierten DNA misst.

Dieses Video zeigt einen in vivo Assay in Bakterien, um die Interaktion von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) mit RNA zu untersuchen. Die Bakterienzellen werden mit zwei Plasmidkonstrukten transformiert – einem Plasmid an der Bindungsstelle, das für eine mRNA kodiert, die ein fluoreszierendes Reportergen stromabwärts einer RBP-Bindungsstelle enthält –, während ein RBP-Plasmid die RBP-Proteine unter der Kontrolle eines Induktors exprimiert. Bei einer durch Induktoren vermittelten Erhöhung der...

In diesem Video demonstrieren wir den modifizierten Hefe-Ein-Hybrid-Assay, der mehrere Proteine nachweist, die mit der Ziel-DNA interagieren. Die transformierten Hefezellen enthalten die Ziel-DNA-Sequenz stromaufwärts des Reportergens. Zusätzlich exprimieren sie Transkriptionsfaktor-Proteine. Wenn die Proteine Komplexe bilden und an die Ziel-DNA binden, wird das Reportergen exprimiert und kann enzymatisch nachgewiesen werden.

In diesem Video demonstrieren wir das Verfahren zur Bestimmung der Helikase-Aktivität eines Zielproteins, um das Biotin-markierte dsRNA-Substrat abzuwickeln. Die Aktivität des Enzyms wurde durch die Analyse der elektrophoretischen Mobilitätsverschiebung identifiziert, gefolgt von einem Chemilumineszenz-Assay mit chemilumineszierendem Enzym-konjugiertem Streptavidin.

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmethode, um die Lokalisation der DNA-Reparaturproteine γH2AX und 53BP1 an den Stellen von Doppelstrang-DNA-Brüchen in bestrahlten Zellkernen sichtbar zu machen.

Dieses Video zeigt einen in vitro RNA-Pulldown-Assay zur Identifizierung von RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die mit den Adenylat-Uridylat-Rich Element (ARE)-Sequenzen in mRNA interagieren. Die Ziel-RBPs aus einem Zelllysat werden mit einer RNA-Sonde gemischt, um RNA-Protein-Komplexe zu bilden. Die Komplexe werden mittels Affinitätsreinigung isoliert, wobei die Affinität der Desthiobiotin-Markierung der RNA-Sonde zu einem Streptavidin-markierten magnetischen Kügelchen genutzt wird.

In diesem Video beschreiben wir die systematische Evolution von Liganden mit der Exponentialanreicherungsmethode (SELEX), um spezifische RNA-Bindungssequenzen für ein Zielprotein von Interesse zu identifizieren. Das Protein wird mit einem großen Pool randomisierter RNA-Sequenzen inkubiert, und die proteinbindenden RNA-Sequenzen werden isoliert, PCR-amplifiziert und sequenziert, um ihre Proteinbindungsstellen zu identifizieren.

Dieses Video beschreibt eine Methode, um die Assemblierung von Fusionsprotein-Kondensaten auf DNA-Molekülen an bestimmten Loci mit Hilfe von Einzelmolekül-Bildgebung zu visualisieren. Diese Kondensate werden durch LCD-LCD- und LCD-DBD-Wechselwirkungen gebildet, die die Rekrutierung von RNA-Polymerase II und eine verbesserte Gentranskription ermöglichen.

Dieses Video demonstriert die dynamische Differenzkalorimetrie — eine Technik zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen einem Biomolekül und einem Liganden. Die Bindung eines DNA-Aptamers und eines thermolabilen Liganden wird untersucht, indem wiederholte Heiz- und Abkühlzyklen auf die Probe angewendet und Scans für die thermodynamische Analyse durchgeführt werden.

Dieses Video demonstriert die mikroskalige Thermophorese zur Untersuchung der Protein-Lipid-Wechselwirkung. Der Assay detektiert die Wechselwirkung zwischen Molekülen, indem er die thermophoretische Bewegung von fluoreszenzmarkierten Proteinen als Reaktion auf einen Temperaturgradienten quantifiziert. Das fluoreszierende Molekül wird mit unterschiedlichen Konzentrationen der nicht fluoreszierenden Lipidmoleküle gemischt, und das Molekülgemisch in der Lösung wird in Kapillaren geladen. Dabei...

In diesem Video demonstrieren wir die Interaktion zwischen Proteinen und künstlichen Phospholipid-Vesikeln mittels quantitativer Durchflusszytometrie. Die Bindung von fluoreszenzmarkierten Proteinen an fluoreszenzmarkierte Phospholipid-Vesikel erhöht die mittlere Fluoreszenzintensität, und dieser Anstieg wird mit einem Durchflusszytometer nachgewiesen.

Dieses Video demonstriert eine dissipative Mikrogravimetrie-Technik, um die Bindung von Proteinen an Lipiddoppelschichten zu untersuchen. Kleine unilamelläre Vesikel werden hinzugefügt, um die Oberfläche des Quarzsensors einer Mikrowaage zu beschichten. Unter Verwendung der Calciumionen-abhängigen Bindung des Zielphospholipid-bindenden Proteins an die Doppelschicht werden Änderungen der Schwingungsfrequenz des Sensors und der Dissipation der Oszillation überwacht, um die Art der...

In diesem Video demonstrieren wir Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen in einem mikrofluidischen Muster unter Verwendung des pH-Modulationsassays unter Verwendung eines pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, der an das Phosphatidylethanolamin-Lipid einer unterstützten Lipiddoppelschicht, einer sogenannten mikrofluidischen Plattform, gebunden ist. Die Modulation des pH-Werts nach der Proteinbindung an Phospholipid führt zu einer Fluoreszenzlöschung.