1. Bereiten Sie die Durchflusskammern vor
- Reinigen Sie die Glasdeckgläser
- Spülen Sie die Deckgläser im Format 24 mm x 50 mm mit Waschflaschen mit destilliertem Wasser, Ethanol und Isopropanol in der folgenden Reihenfolge aus: Wasser, Ethanol, Wasser, Isopropanol, Wasser. Trocknen Sie die Deckgläser mit einem Strahl sauberen Stickstoffs. Es ist wichtig, die Deckgläser von oben nach unten zu spülen und die untere Ecke mit einer weichen Pinzette festzuhalten. Trocknen Sie das Deckglas in die gleiche Richtung, um eine Übertragung von Verunreinigungen von der Pinzette zu vermeiden (Abbildung 1A).
- Spülen Sie auf ähnliche Weise die 24 mm x 24 mm großen Deckgläser mit destilliertem Wasser, Ethanol und destilliertem Wasser ab. Trocknen Sie die Deckgläser mit einem Strahl sauberen Stickstoffs.
- Identifizieren Sie die Arbeitsseite des Deckglases, geben Sie einen Tropfen destilliertes Wasser auf die Oberfläche des sauberen Deckglases und befolgen Sie die Schritte 3.1 bis 3.2 des Protokolls. In der Regel hat nur eine Seite des Deckglases 24 mm x 50 mm die optische Qualität, die für MP-Messungen geeignet ist.
Anmerkung: Nach dem Fokussieren sollten keine signifikanten Oberflächenfehler erkennbar sein, und der in der Datenerfassungssoftware angezeigte "Signal"-Wert sollte weniger als 0,05 % betragen (Abbildung 2A-C). Die Arbeitsseiten aller Deckgläser in der Schachtel sind in die gleiche Richtung ausgerichtet. Das gleiche Verfahren sollte verwendet werden, um die Wirksamkeit der Deckglasreinigung zu testen.
- Montieren Sie die Durchflusskammer
- Positionieren Sie das Deckglas 24 mm x 24 mm auf ein Stück Alufolie. Legen Sie doppelseitiges Klebeband auf das 24 mm x 24 mm große Deckglas, wie in Abbildung 1B gezeigt, und schneiden Sie das Klebeband entlang der Glaskante ab. Trennen Sie das Deckglas von der Aluminiumfolie und befestigen Sie es an der Arbeitsseite des Deckglases mit den Maßen 24 mm x 50 mm (Abbildung 1C).
Anmerkung: Die Kanalgröße kann variieren, aber eine Breite von 3 mm bis 5 mm wird empfohlen. Breitere Kanäle erfordern größere Probenvolumina und sehr schmale Kanäle können schwierig zu laden sein. In der Regel können auf dem Deckglas 24 mm x 24 mm problemlos zwei parallele Kanäle erstellt werden. Das Protokoll kann hier pausiert werden.
2. Bereiten Sie die Antikörper-Antigen-Proben für die Affinitätsmessungen vor
- Mindestens 2 ml des PBS-Puffers mit 0,22 μm Spritzenvorsatzfiltern filtrieren, um Staubpartikel oder Zuschlagstoffe zu entfernen. Zentrifugieren Sie die Proteinbrühe 10 Minuten lang bei der maximalen Drehzahl der Tischzentrifuge (ca. 16.000 x g).
Anmerkung: PBS ist der empfohlene Puffer für dieses Protokoll, aber MP hat keine besonderen Pufferanforderungen, und andere biologische Puffer sind ebenfalls akzeptabel. Hohe Glycerinkonzentrationen (>10%) und sehr geringe Ionenstärken (Salzkonzentration <10 mM) können jedoch die Bild- und Datenqualität beeinträchtigen und werden nicht empfohlen.
- Bestimmen Sie die tatsächlichen Konzentrationen der Antikörper- und Antigenbestände durch Messung ihrer UV-Absorption von 280 nm.
- Berechnen Sie die gemessenen Konzentrationen des Antigen-Antikörper-Gemisches. Wenn der geschätzte Wert der Antikörperbindungsaffinität nicht bekannt ist, planen Sie die Vorbereitung einer Probe mit einer Antigenkonzentration von 30 nM und einer Antikörperkonzentration von 20 nM. Wenn die ungefähre Affinität bekannt ist, sollten das Antikörper-Antigen-Verhältnis und ihre Konzentrationen entsprechend den erwarteten Kd-Werten optimiert werden. Verwenden Sie die Gesamtantigenkonzentration in der Mischung, die der Summe aus dem erwarteten Kd und der Gesamtantikörperkonzentration in der folgenden Gleichung entspricht. Unter der Annahme, dass Kd1 = Kd2 für die beiden Paratope des Antikörpers ist, ergeben sich vergleichbare Konzentrationen des freien Antikörpers und der Antikörper-Antigen-Komplexe in der Probe.
Passen Sie die Antikörperkonzentration an, um die Gesamtproteinkonzentration in der Probe im Bereich von 10 nM und 50 nM zu halten. Die besten Ergebnisse werden mit Mischungen mit Antikörperkonzentrationen zwischen 5 nM und 25 nM erzielt.
Anmerkung: MP weist Proteine mit einer Molekülmasse von mehr als 40 kDa nach. Folglich können Probenkonzentrationen von Antigenen mit einer Molekülmasse von weniger als 40 kDa den typischen Grenzwert von 50 nM überschreiten. Bei Konzentrationen über etwa 100 nM können jedoch selbst Antigene mit niedriger molekularer Masse die Bildqualität und Genauigkeit der Kd-Bestimmung beeinträchtigen.
- 50 μl des Antikörper-Antigen-Gemisches werden in der in Schritt 2.3 berechneten endgültigen Messkonzentration hergestellt.
Anmerkung: Für die Kd-Bestimmung wird nur eine Probe des Antigen-Antikörper-Gemisches benötigt. Die Vorbereitung mehrerer Proben mit unterschiedlichen Antigen-Antikörper-Verhältnissen kann jedoch dazu beitragen, die Probenkonzentration zu optimieren. Werden Daten von mehreren Proben gesammelt, können diese über einen Global Fit analysiert werden.
- Die Antigen-Antikörper-Mischung(en) werden ca. 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, damit die Bindungsreaktion ein chemisches Gleichgewicht erreichen kann. Vermeiden Sie unnötig lange Inkubationszeiten.
Anmerkung: Die Inkubationszeit kann je nach Bindungskinetik variieren. Um zu bestätigen, dass das chemische Gleichgewicht erreicht wurde, können Probenmessungen zu unterschiedlichen Inkubationszeiten wiederholt werden. Zeitinvariante Kd-Werte weisen auf eine ausreichend lange Inkubation hin. Eine längere Inkubation kann zu einer signifikanten Proteinadsorption an der Oberfläche des Laborgeräts aus Kunststoff und folglich zu erheblichen Fehlern bei der Bestimmung der Proteinkonzentration führen. Aus diesem Grund wird Laborgeräte mit geringer Adhäsion für die Probenvorbereitung von MP dringend empfohlen.
3. Sammeln Sie die Massenphotometrie-Daten
- Tragen Sie einen Tropfen Mikroskop-Immersionsöl auf das MP-Instrumentenobjektiv auf und platzieren Sie die zusammengebaute Durchflusskammer auf dem Mikroskoptisch. Stellen Sie sicher, dass das Öl den Spalt zwischen dem Deckglas und dem Objektiv überbrückt.
- Laden Sie die Durchflusskammer und fokussieren Sie das Massenphotometer.
- 10 μl einer sauberen, filtrierten Pufferlösung werden an einem Ende des in Schritt 1 vorbereiteten Durchflusskammerkanals abgegeben. Flüssigkeit gelangt durch Kapillarwirkung in den Kanal.
- Stellen Sie die Z-Position des Tisches ein, um das Mikroskop auf die Arbeitsfläche des 24 x 50 mm großen Deckglases zu fokussieren.
- Verwenden Sie auf der Registerkarte "Fokussteuerung" der Datenerfassungssoftware die Tasten für die grobe Tischbewegung nach oben und unten, um die ersten Anpassungen vorzunehmen.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Schärfe, um die Anzeige des Schärfesignals anzuzeigen, und verwenden Sie die feinen Einstelltasten nach oben und unten, um den Schärfewert zu maximieren.
- Klicken Sie auf die Schaltflächen Fokus einstellen und Fokus sperren, um die Fokusverfolgungsfunktion zu aktivieren. Ein richtig fokussiertes Bild (Abbildung 2A, C) sollte einen "Signal"-Wert unter 0,05 % haben.
Anmerkung: Liegt der "Signal"-Wert in der maximalen Schärfeposition über 0,05 %, kann dies auf Verunreinigungen auf der Glasoberfläche oder im Puffer hinweisen.
- Laden Sie mit demselben Kanal 20 μl der Antikörper-Antigen-Probe, indem Sie sie auf einer Seite des Kanals ablegen und die Flüssigkeit vom anderen Ende mit einem kleinen Stück Löschpapier abtupfen (Abbildung 1D).
Anmerkung: Das Volumen eines 3–5 mm breiten Kanals beträgt ca. 10 μL. Das zusätzliche Probenvolumen wird empfohlen, um den im Kanal vorhandenen Puffer vollständig zu ersetzen und eine Probenverdünnung zu vermeiden.
- Klicken Sie nach dem Laden der Probe sofort auf die Schaltfläche Aufzeichnen, um die Datenerfassung zu starten und ein 100-s-Video aufzunehmen (Abbildung 2D).
- Geben Sie am Ende der Datenerfassung den Dateinamen ein, und klicken Sie auf OK, um die Datendatei zu speichern.
- Entsorgen Sie die Deckgläser und wischen Sie das Öl mit mit Isopropanol angefeuchteten Wattestäbchen von der Objektivlinse ab.
Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
4. Analysieren Sie die MP-Daten
- Verarbeiten Sie die gesammelte Videodatei mit der MP-Datenverarbeitungssoftware, um die Landeereignisse zu identifizieren.
- Verwenden Sie die Menüoption Datei/Öffnen, um die Datei für die Analyse zu laden, und klicken Sie auf Analysieren.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Laden, um die Kalibrierungsfunktion zu laden und die analysierten Daten über den Menüpunkt Datei/Ergebnisse speichern unter zu speichern.
- Passen Sie die Molekülmassenverteilung an Gaußsche Funktionen an, um die relativen Konzentrationen jeder Spezies in der Probe zu erhalten. Diese Analyse kann mit einer gängigen wissenschaftlichen Grafiksoftware durchgeführt werden (siehe Materialtabelle).
- Importieren Sie die Datei "eventsFitted.csv" in die Software und zeichnen Sie die Molekülmassenverteilung (Spalte M in der .csv Datei) mit der Funktion Zeichnen/Statistik/Histogramm auf.
- Doppelklicken Sie auf das Histogramm, um das Fenster Zeichnungseigenschaften zu öffnen. Deaktivieren Sie das automatische Binning und wählen Sie eine Bin-Größe von 2,5 kDa. Klicken Sie auf die Schaltflächen Übernehmen und Los, um die Daten für die Lagerplatzzentren und -zählungen zu erstellen.
- Wählen Sie die Spalten Bin-Zentren und Anzahl aus und verwenden Sie die Menüfunktionen Analyse/Peaks und Baseline/Multiple Peak-Anpassung, um das Histogramm mit Gauß-Funktionen anzupassen. Doppelklicken Sie, um die ungefähren Peakpositionen im Verteilungsdiagramm anzugeben, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche NLFit öffnen.
- Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Fix für die "xc"-Peakzentren und setzen Sie deren Werte auf die erwarteten Molekülmassen des freien Antikörpers und der einfachen und doppelten Antigen-Antikörper-Komplexe. Aktivieren Sie die Option Freigeben für die Breitenparameter. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anpassen. Die angepassten Spitzenhöhenwerte der Gaußschen Komponenten stellen die relative Konzentration jeder Spezies in der Probe dar.
Anmerkung: Die Abschnittsgröße kann angepasst werden, um die Auflösung des Massenverteilungsdiagramms zu optimieren. Der MP-Genauigkeitsgrenzwert liegt bei ca. 1 kDa, und kleinere Bin-Größen können das Rauschen der Verteilung verstärken, ohne zusätzliche Informationen preiszugeben. Sehr große Bin-Größen verdecken die feinen Details von Massenverteilungen.
- Berechnen Sie den Konzentrationsanteil jeder Spezies mit der folgenden Gleichung:
wobei die hi und fi Werte die Peakhöhen und Konzentrationsanteile des freien Antikörpers bzw. des einfach bzw. doppelt gebundenen Antikörpers in der Probe darstellen.
