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1. Vorbereitung des Agarose-Pads (Abbildung 1)
- Legen Sie einen Objektträger aus Mikroskopglas auf eine flache horizontale Fläche. Ordnen Sie zwei Objektträger an, die auf jeder Seite der ursprünglichen Folie mit zwei Lagen Klebeband bedeckt sind.
Anmerkung: Halten Sie mit Klebeband einen Abstand von 1-2 mm zwischen den drei ausgerichteten Objektträgern ein, um zu verhindern, dass sich die geschmolzene Agarose schließlich auf den Objektträgern ausbreitet.
- Pipettieren Sie und gießen Sie einen Tropfen mit 70 μl 1 % geschmolzener Agarose auf den Objektträger. Füge eine vierte Folie auf die Oberseite ein, um das Agarose-Tröpfchen flach zu drücken, und drücke es leicht nach unten. Warten Sie etwa eine Minute.
- Nehmen Sie den oberen Objektträger ab und tropfen Sie mit einer Pipette etwa 3 μl Bakterien an 3 bis 4 Stellen an verschiedenen Stellen auf das Agarose-Pad.
- Abdeckung mit einem Deckglas aus Mikroskopieglas (z.B. 22x22 mm #1,5 Dicke).
Anmerkung: Ebenheit und Dicke der Deckgläser sind wichtig für die Arbeit mit Zwei-Photonen-Anregungen. Präzisionsdeckgläser mit kontrollierter gleichmäßiger Planheit und geringer Autofluoreszenz sind in der Regel eine gute Wahl.
- Fixieren Sie das Deckglas mit geschmolzenem Paraffin, um das Deckglas auf dem Objektträger zu versiegeln. Beginnen Sie damit, die vier Ecken des Deckglases zu fixieren.
2. Bildgebung mit einem Zwei-Photonen-Mikroskopie-Setup
HINWEIS: Wir verwenden ein selbstgebautes inverses Zwei-Photonen-Anregungs-Rastermikroskop mit einem 60x 1,2NA Wasserimmersionsobjektiv, das im de-gescannten Fluoreszenzsammelmodus arbeitet. Die Wellenlänge der Zwei-Photonen-Anregung ist auf 930 nm eingestellt. Dafür sorgt ein Ti:Saphir-Laser (80 MHz Wiederholrate, ≈ 70 fs Pulsbreite), der mit 10-20 mW arbeitet. Fluoreszenzphotonen wurden durch einen 680-nm-Kurzpassfilter und einen 525/50-nm-Bandpassfilter gesammelt, bevor sie zu einer fasergekoppelten Avalanche-Fotodiode geleitet wurden, die mit einem zeitkorrelierten Einzelphotonenzählmodul (TCSPC) verbunden war. Das Mikroskop ist außerdem mit einer Transmissionsfluoreszenzlampe ausgestattet. Mehrere FLIM-FRET-Mikroskope sind jetzt kommerziell erhältlich und viele bildgebende Einrichtungen sind mit Setups ausgestattet, die FLIM-FRET-Messungen durchführen können.
- Verwenden Sie die Fluoreszenzlampe, um das Objektiv auf die Monoschicht von Bakterien in der Probe zu fokussieren und die interessierenden Regionen auszuwählen.
- Vergewissern Sie sich, dass der Anregungslaserverschluss geschlossen ist und dass das vom Laser kommende Infrarotlicht blockiert wird und nicht in das Mikroskop eindringt.
Vorsicht: Bei der Arbeit mit IR-gepulsten Lasern ist besondere Aufmerksamkeit und ständige Wachsamkeit geboten, da das Laserlicht mit den Augen nicht gesehen werden kann, aber jede und sogar vorübergehende direkte Exposition oder Laserreflexion äußerst schädlich sein und irreversible Augenschäden verursachen kann. Bitte informieren Sie sich über die lokalen Lasersicherheitsverfahren und -schulungen, bevor Sie Mikroskopie-Setups verwenden.
- Legen Sie den Objektträger auf den Tisch, wobei die Deckgläser zum Objektiv zeigen.
- Vergewissern Sie sich, dass die Leuchtstofflampe eingeschaltet ist.
- Drehen Sie den Revolver des Filterwürfels, um den eGFP-Würfel auszuwählen und den Verschluss der Leuchtstofflampe zu öffnen.
- Senden Sie das Fluoreszenzlicht in Richtung des Okulars des Mikroskops.
Vorsicht: Stellen Sie sicher, dass geeignete Filter im Strahlengang entsorgt sind, um direktes Anregungslicht von der Fluoreszenzlampe zu verschließen, das die Augen schädigen kann.
- Fokussieren Sie das Objektiv mit dem Mikroskopknopf auf Bakterien.
- Wählen Sie einen Bereich von Interesse in der Probe aus, indem Sie ihn mit dem Joystick verschieben, der den motorisierten Tisch steuert
Anmerkung: Die Fokussierung ist bei stark fluoreszierenden Proben einfacher, so dass die Fluoreszenz direkt mit den Augen gesehen werden kann.
- Schalten Sie die Anregung für den 2PE-Laser für FLIM-FRET-Messungen um.
- Senden Sie den Fluoreszenzemissionspfad zurück zum Detektor.
- Drehen Sie den Revolver des Filterwürfels zurück, um den dichroitischen Würfel für den 930-nm-Laser auszuwählen.
- Stellen Sie die Laserleistung auf 20 mW ein.
- Legen Sie die Größe des interessierenden Bereichs auf 30 μm fest. Dieser Vorgang stellt die Spannung ein, die die Galvospiegel betätigt, und definiert den Bereich ihrer Bewegungen (Abbildung 2).
- Schalten Sie den Detektor ein und beginnen Sie mit dem Scannen der Probe - die Start- und Stopptasten, die den Scanvorgang steuern, steuern auch das Öffnen und Schließen des Laserverschlusses, sowohl aus Sicherheitsgründen als auch zur Begrenzung des Photobleachings der Probe (Abbildung 2).
- Stellen Sie bei Bedarf den Fokus ein, indem Sie den Feinfokusknopf des Mikroskops leicht bewegen.
- Wählen Sie das Sichtfeld für die Bildgebung, indem Sie den Tisch von der Computerschnittstelle aus fein bewegen. Dies kann am Setup erfolgen, indem Sie das Kreuz auf dem Bild in der Mikroskopsteuerungssoftware (Abbildung 2) verschieben, die die neue Bildmitte definiert, und auf "Tisch verschieben" drücken. Ein gutes Sichtfeld für die Aufnahme entspricht einem Bild mit 10-30 unbeweglichen Bakterien, die alle korrekt fokussiert sind (alle Bakterien befinden sich auf derselben Ebene). Wenn Sie an der Extraktion von FLIM-FRET-Daten einzelner Zellen interessiert sind, stellen Sie sicher, dass die Bakterien gut individualisiert sind (die Bildsegmentierung ist viel einfacher).
