Zellaggregationsassay zum Nachweis von Trans-Wechselwirkungen zwischen Zelladhäsionsmolekülen

Abstract

Quelle: Restrepo, S., et al., Messung transzellulärer Wechselwirkungen durch Proteinaggregation in einem heterologen Zellsystem. J. Vis. Exp. (2020)

In diesem Video demonstrieren wir die Technik zur Messung transzellulärer Wechselwirkungen zwischen synaptischen Zelladhäsionsmolekülen durch den HEK-Zellaggregationsassay. In diesem Assay wird eine gleiche Anzahl von HEK-Zellen, die ein gewünschtes präsynaptisches Zelladhäsionsmolekül exprimieren, und ein fluoreszierendes Protein mit HEK-Zellen gemischt, die ein postsynaptisches Zelladhäsionsmolekül und ein weiteres fluoreszierendes Protein exprimieren. Die Wechselwirkung zwischen den Zelladhäsionsmolekülen zwingt die Zellen zur Aggregation, was mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie gemessen werden kann.

Protocol

1. Zellkultur und Transfektion

1. Stellen Sie HEK-Zellmedien mit DMEM her, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium), ergänzt mit 4,5 g/L Glukose, L-Glutamin und Natriumpyruvat und 10% FBS. Sterilfilter.
2. Bestimmung geeigneter Liganden und Rezeptoren für den Aggregationsassay.
   Anmerkung: Neurexin3α SS4+/- und einer seiner bekannten Liganden, LRRTM2, wurden in dieser Studie verwendet. Liganden und Rezeptoren von Interesse wurden aus cDNAs in pcDNA3.1 exprimiert. Eine Gibson-Assemblierung wurde verwendet, um Neurexin3α in pcDNA3.1 einzubauen. Neurexin3α F/R:
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. Bereiten Sie HEK293T Zellen vor.
   1. Züchten Sie HEK293T Zellen in einem T-75-Kolben bis zur Konfluenz.
   2. Nach der Konfluation werden 2 ml Trypsin verwendet und 2 Minuten lang in einen 37 °C-Inkubator gestellt. 6 ml HEK-Medium werden in den Kolben gegeben, um die Zellen zu resuspendieren, und alle 8 ml in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt.
   3. Pelletieren Sie 5 min lang bei 500 x g und resuspendieren Sie es in HEK-Zellmedien für insgesamt 8 mL.
   4. Zählen Sie die Zellen und geben Sie 735.000 Zellen in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Stellen Sie das endgültige Volumen auf 2 mL für jede Vertiefung mit HEK-Zellmedien ein.
   5. In einen 37 °C heißen Inkubator stellen und die Zellen über Nacht oder bis zu einer Konfluenz von 50-60 % wachsen lassen.
4. Transfizieren Sie HEK293T Zellen mit der Calciumphosphat-Methode.
   1. Transfizieren Sie Well-1 mit 3 μg des interessierenden Proteins und co-transfizieren Sie mit 1 μg fluoreszierendem Protein (3 μg pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- und 1 μg mCherry).
   2. Transfizieren Sie Well-2 wie in Schritt 1.4.1., jedoch mit dem mutierten Protein von Interesse (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-).
   3. Transfizieren Sie Well-3 mit 3 μg des interessierenden Liganden und co-transfizieren Sie mit 1 μg eines anderen fluoreszierenden Proteins (3 μg pcDNA3.1 LRRTM2 und 1 μg GFP).
   4. Transfizieren Sie Well-4 und Well-5, um als Negativkontrollen zu dienen: Well-4 mit 1 μg GFP und Well-5 mit 1 μg mCherry.
   5. Bereiten Sie eine weitere Platte vor (wie in den Schritten 1.4.1-1.4.4), wenn zusätzliche Bedingungen oder Kontrollen erforderlich sind (Neurexin3α^WT/A687T SS4+).
      Anmerkung: Die Transfektionseffizienz wird 24 Stunden nach der Transfektion unter einem Epifluoreszenzmikroskop analysiert und quantifiziert als die Anzahl der Zellen, die das fluoreszierende Protein exprimieren, mit dem sie transfiziert wurden. Ein schlankerer Ansatz würde die Transfektion von HEK-Zellen mit einem bicistronischen Vektor umfassen, der für ein fluoreszierendes Protein und den interessierenden Liganden kodiert, und wird vor der Co-Transfektion dringend empfohlen. Im Fall dieser Studie betragen die Alpha-Neurexine ~4,3 kb und es wurde eine geringe Fluoreszenzintensität mit einem bicistronischen System beobachtet, das eine Co-Transfektion erforderte.
5. 48 Stunden nach der Transfektion Zellen für die Aggregation ernten.
   1. Waschen Sie jedes Mal gut mit PBS.
   2. Geben Sie 1 ml 10 mM EDTA in PBS in jede Vertiefung, um Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen sanft zu dissoziieren, und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 5 min.
      Anmerkung: Trypsin wird für Schritt 1.5.b aufgrund der potenziellen proteolytischen Spaltung von Adhäsionsmolekülen in der Studie nicht empfohlen. Darüber hinaus kann das Protokoll nach der EDTA-Zugabe bis zum Abschluss nicht gestoppt werden, da die Zellen nun den Umgebungsbedingungen ausgesetzt sind.
   3. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Zellen zu lösen, und ernten Sie jede Vertiefung in separate konische 15-ml-Röhrchen.
   4. Konische Röhrchen bei 500 x g und Raumtemperatur 5 min zentrifugieren.
6. Während die Zellen pelletieren, bereiten Sie 6 Inkubationsröhrchen vor, indem Sie die Oberseite jedes Mikrozentrifugenröhrchens mit jeder Bedingung beschriften.
   Anmerkung: Jede Permutation von GFP- und mCherry-Bedingungen sollte so verwendet werden, dass sie alle Versuchsbedingungen und die richtigen Kontrollen umfasst. Zum Beispiel: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3α^WT SS4-—mKirsche, 4. GFP/Neurexin3α^A687T SS4- –mKirsche, 5. Neurexin3α^WT SS4--mCherry/LRRTM2-GFP, 6. Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry/LRRTM2–GFP. Stellen Sie zusätzliche Rohre her, um weitere Bedingungen und Kontrollen aufzunehmen.
7. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl HEK-Medien mit 10 mM CaCl₂ und 10 mM MgCl₂, erwärmt auf 37 ΰC.
   Anmerkung: Die Zugabe von CaCl₂ und MgCl₂ ermöglicht es den Adhäsionsmolekülen, die Bindung wiederherzustellen und ist nur erforderlich, wenn die betreffenden transzellulären Interaktionspartner zweiwertige Kationen für die Adhäsion benötigen.
8. Zählen Sie die Zellen in jedem konischen 15-ml-Röhrchen mit einem Hämozytometer und aliquotieren Sie 200.000 Zellen jeder Bedingung in ein geeignetes Röhrchen aus Schritt 1.6 für eine 1:1-Mischung mit einem Gesamtvolumen von 500 μl.
   Anmerkung: Es sollte nur 5 Minuten pro Bedingung dauern, um Mengen zu zählen und zu aliquotieren.
9. Inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur in einem langsamen Röhrchenrotator.

2. Bilderfassung

1. Optimieren Sie die Mikroskopaufnahmeparameter für bestimmte Proben. In diesem Beispiel wurden Bilder mit einem Weitfeldmikroskop aufgenommen. Verwenden Sie ein 5x Luftobjektiv (NA: 0,15; WD: 20000 μm), um ein ausreichend großes Feld für die Analyse zu erhalten.
2. Beurteilen Sie die Aggregation zu Studienbeginn unmittelbar nach dem Mischen der beiden Bedingungen von HEK-Zellen in Schritt 1.8. Dies sind nun die "Zeit Null"-Bilder.
   1. Pipettieren Sie 40 μl jeder Probenmischung auf einen geladenen Objektträger und nehmen Sie ein Bild unter Fluoreszenz in den Kanälen 488 und 561 auf.
   2. Erfassen Sie drei verschiedene Sichtfelder in einer Fokusebene pro Probentropfen.
3. Nehmen Sie die endgültigen Bilder bei 60 Minuten als "Zeit 60"-Bild auf.
   1. Um das "Zeit 60"-Bild der Mischung nach einer 60-minütigen Inkubation zu erhalten, entnehmen Sie weitere 40 μl Probe jeder Bedingung aus rotierenden Röhrchen und pipettieren Sie jede Probe auf einen geladenen Objektträger. Bild wie in Schritt 2.2.
      Anmerkung: Die Zellaggregation sollte alle 15 Minuten überprüft werden, bis die Sättigung eintritt. Der Zeitpunkt der Aggregation hängt von den zu testenden Proteinen ab.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 mL Einweg-Mikroröhrchen mit Schnappverschlüssen	VWR	Artikel-Nr.: 89000-028	Inkubation einer gemischten Population von HEK-Zellen
1000 mL Schnellstrom-Filtereinheit, 0,2 μm aPES-Membran	Thermo Fischer	Tel.: 567-0020	Sterilisation von HEK-Medien
15 mL SpectraTube Zentrifugenröhrchen	Wards Wissenschaft	Artikel-Nr.: 470224-998	Ernte von HEK-Zellen
Sterile 6-Well-Gewebekulturplatten	VWR	Tel.: 100062-892	Kultivierung von HEK-Zellen
Calciumchlorid	Sigma	Artikel-Nr.: 223506-500G	Transfektion von Calciumphosphat, Resuspension von HEK-Zellen
Zentrifuge - Sorvall Legend RT	Kendro Laborprodukte	75004377	Ernte von HEK-Zellen
CO2 -Zell-Inkubator	Thermo Scientific	HERACELL 150i	Inkubation von HEK-Zellen während des Wachstums
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) mit 4,5 g/L Glukose, L-Glutamin & Natriumpyruvat	Corning	10-013-CV	Wartung der HEK-Zellen
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung PBS (1X)	Gibco	Nr. 14190-144	Passieren/Ernten von HEK-Zellen
Ethylendiamintetraessigsäure	Sigma	ED-500G	Ernte von HEK-Zellen
Falcon Vented Kulturflaschen, 75cm2 Wachstumsfläche	Corning	9381M26	Kultivierung von HEK-Zellen
Fötales Rinderserum	Sigma	Nr. 17L184	Wartung der HEK-Zellen
HEK293T Zellen	ATCC		Modellsystem
BildJ	Nih	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	Bildanalyse
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	Sigma	M9272-500G	HEK-Zell-Resuspension
Natriumphosphat, zweibasisch, wasserfrei	Fisher BioReagenzien	Nr. BP332-500	Transfektion von Calciumphosphat
Trypsin 0,25% (1X) Lösung	GE Healthcare Life Sciences	SH30042.01	Passieren von HEK-Zellen
Rotator für Rohre			Inkubation einer gemischten Population von HEK-Zellen
UltraClear Objektträger. Weiß mattiert, positiv geladen	Denville Scientific Inc.	M1021	Bilderfassung
Weitfeld-Mikroskop	Zeiss	Axio Vert 200M	Bilderfassung