HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet C. elegans-Stämme, in denen potenzielle Interaktionspartner beide markiert sind. Es wird dringend empfohlen, einen negativen Kontrollstamm zu verwenden, bei dem nicht erwartet wird, dass ein markiertes Protein mit einem anderen markierten Interaktionspartner interagiert. Hier wurde GFP allein als Negativkontrolle zur Beurteilung des Hintergrunds verwendet, da nicht erwartet wird, dass DLC-1 mit GFP im Wurm interagiert. Als experimenteller Stamm wurde GFP-markiertes OMA-1 verwendet, da vorläufige Daten auf eine Wechselwirkung mit DLC-1 hindeuten. Nematodenstämme, die Kontroll- und Testproteine mit 3xFLAG-markiertem DLC-1 koexprimieren, werden in diesem Text als 3xFLAG::D LC-1 bezeichnet; GFP und 3xFLAG::D LC-1; OMA-1::GFP (Stämme auf Anfrage erhältlich; weitere Informationen in der Materialtabelle). Hier kommen die Tags 3xFLAG und GFP zum Einsatz; Andere Tags können jedoch ersetzt werden, solange ihre Antikörper mit den Reagenzien des PLA-Kits kompatibel sind.
1. Tierpflege
- Bewahren Sie die Würmer auf Nematoden-Wachstumsmediumplatten (NGM) auf, die mit dem OP50-Stamm von E. coli besät sind, und halten Sie sie bei 24 °C, um eine optimale Expression von GFP zu gewährleisten.
- Lassen Sie erwachsene Würmer alle 2-3 Tage passieren, um die Würmer zu vermehren und sie gut zu füttern.
2. Vorbereitung der synchronen Kultur
- Synchronisieren Sie Würmer, indem Sie eine Platte mit gut genährten, trächtigen Hermaphroditen bleichen. Ein Bleaching-Protokoll wird in Porta-de-la-Riva et al. beschrieben. Lassen Sie die Embryonen über Nacht in einem Zentrifugenröhrchen bei 24 °C schlüpfen, während Sie sich in 10 ml M9-Minimalmedienpuffer (M9) drehen. Dadurch entsteht eine Kultur von verhafteten L1-Larven.
- Inkubieren Sie das Röhrchen mit den gefangenen Larven im L1-Stadium 10 Minuten lang auf Eis und füllen Sie das Röhrchen dann mit eiskaltem 1x M9 auf.
- Die Larven werden mit einer Zentrifuge bei 600 x g für 5 min bei 4 °C pelletiert. Der Überstand wird vorsichtig abgesaugt, so dass nur noch 1-2 ml Überstand übrig bleibt.
- Das Pellet der Larven resuspendieren und mit einer Mikropipette 2 μl suspendierte Larvenkultur auf einen Objektträger übertragen. Zählen Sie, wie viele Larven vorhanden sind, um die Dichte der Larvenkultur zu bestimmen, was bei der Aussaat der Würmer in Schritt 2.5.
hilft.
Anmerkung: Eine Dichte von 10-15 L1 Larven/1 μl eignet sich gut für die Aussaat.
- Verwenden Sie eine Mikropipette, um das Volumen der Larvenkultur zu übertragen, das zum Aussäen von etwa 100-120 Larven im L1-Stadium auf einer 60-mm-OP50-Platte benötigt wird. Zum Beispiel: 10 μl einer Larvenkultur mit einer Dichte von 10 L1 Larven/1 μl Kultur aussäen.
Anmerkung: Überschreiten Sie nicht ein Volumen von 40 μl, um die Larven zu säen, da sonst überschüssige Flüssigkeit den OP50-Rasen stört. Wenn das Kulturvolumen 40 μl überschreitet, wiederholen Sie die Schritte 2.3-2.4, um das Volumen weiter zu verringern und die Dichte der Larvenkultur zu erhöhen.
- Züchten Sie Würmer bei 24 °C. Notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem L1 auf der Platte ausgesät wird, und überprüfen Sie regelmäßig das Entwicklungsstadium, um den idealen Zeitpunkt für die Dissektion zu ermitteln.
Anmerkung: 52 Stunden nach der Aussaat von L1 befinden sich Würmer, die bei 24 °C kultiviert werden, in der Regel im Stadium des jungen Erwachsenen, das das ideale Stadium für die Dissektion auf Gonaden-zielgerichtetes PLA ist. Der tatsächliche Zeitpunkt, zu dem die synchronisierten Würmer das junge Erwachsenenstadium erreichen, kann jedoch je nach Stamm und Inkubationstemperatur variieren.
3. Zerlegung/Gonadenextrusion
HINWEIS: Das Dissektion zum Extrudieren der Gonade ist notwendig, damit das auf die Gonade ausgerichtete PLA erfolgreich funktioniert. Dieser Ansatz kann auch Embryonen freisetzen, die ebenfalls mit diesem Protokoll für PLA funktionieren (weitere Informationen finden Sie in der Diskussion). Nach der Dissektion werden sowohl die Negativkontroll- als auch die Versuchsproben fixiert und parallel auf PLA behandelt. Es wird auch vorgeschlagen, dass ein zusätzlicher Satz von Proben zum Zwecke der Fluoreszenz-Co-Immunfärbung hergestellt wird, um Expressionsmuster der interessierenden Proteinpartner zu demonstrieren.
- Pflücken Sie 30-40 junge adulte Würmer in eine Uhrglasschale mit 500 μl 1x M9 + Levamisol (2,5 mM Endkonzentration). Nachdem Sie die Würmer gesammelt haben, entfernen und entsorgen Sie vorsichtig die meisten Medien, um Bakterien zu entfernen, die zusammen mit den Würmern übertragen werden.
- Fügen Sie frische 500 μl 1x M9 + Levamisol hinzu und verwenden Sie die Pipette, um das Medium vorsichtig aufzuziehen und abzugeben, um die Würmer zu spülen. Entfernen und entsorgen Sie vorsichtig die meisten Medien, um Bakterien zu entfernen, die zusammen mit den Würmern übertragen werden.
- Wiederholen Sie diesen Schritt 2x-3x, bis alle Bakterien entfernt sind. Lassen Sie die Würmer nach Abschluss des Waschvorgangs in etwa 100 μl Medium, um sie mit Feuchtigkeit zu versorgen.
Anmerkung: Lassen Sie die Würmer nicht länger als 7 Minuten im Medium sitzen, da dies die Extrusion der Gonaden während der Dissektion beeinträchtigt. Waschungen mit Hilfe eines Präpariermikroskops durchführen, um die Entfernung des Mediums zu überwachen, damit die Würmer nicht verloren gehen.
- Mit einer Glas- oder Polyethylenpipette übertragen Sie die Würmer auf einen 25 mm x 75 mm großen Objektträger, der mit 0,001 % Poly-L-Lysin beschichtet ist (die bei diesem Verfahren verwendeten Objektträger haben einen epoxidbeschichteten Umfang, so dass drei Arbeitsbereiche von jeweils 14 mm x 14 mm übrig bleiben). Entfernen Sie überschüssiges Medium, so dass ca. 10-15 μl des Mediums übrig bleiben.
- Platzieren Sie mit Hilfe eines Präpariermikroskops und mit zwei Nadeln der Stärke 261/2 eine Nadel über die andere, so dass die Enden eine Schere bilden. Schneiden Sie mit so ausgerichteten Nadeln Würmer hinter dem Rachen, um die Keimbahnen freizusetzen. Zerlegen Sie alle Würmer innerhalb von 5 Minuten.
Anmerkung: Weitere Einzelheiten zur Durchführung von Präparierungen finden Sie in einer früheren Veröffentlichung von Gervaise und Arur.
- Nachdem alle Würmer präpariert sind, legen Sie vorsichtig ein 22 mm x 40 mm großes Deckglas über den Objektträger, so dass es senkrecht zum Objektträger steht. Die Enden des Deckglases sollten von der Folie abhängen.
- Frieren Sie die Objektträger auf einem vorgekühlten Aluminiumblock ein, der mindestens 20 Minuten lang auf Trockeneis aufbewahrt wird. Legen Sie vorsichtig einen gekühlten Bleistift auf das Deckglas, um zu verhindern, dass sich das Deckglas durch Eisausdehnung löst.
4. Fixierung/Blockierung
- Wenn Sie zum Fixieren bereit sind, schnippen Sie die Deckgläser mit einem Bleistift oder einem anderen stumpfen Werkzeug ab und tauchen Sie den Objektträger sofort für 1 Minute in ein Glas mit frischem, eiskaltem Methanol (gekühlt auf -20 °C).
- Wischen Sie vorsichtig über die Ränder des Objektträgers, die die Probe umgeben, so dass das nächste Reagenz durch die Oberflächenspannung um die Probe herum gehalten wird. 150 μl Fixiermittel (2% Formaldehyd in 100 mM KH2PO4, pH = 7,2) für 5 min bei RT.
Anmerkung: Wir haben auch ein Methanol/Aceton-Fixierungsverfahren getestet und festgestellt, dass es mit der PLA-Reaktion kompatibel ist.
- Berühren Sie den Objektträger in einem senkrechten 90°-Winkel mit einem Papiertuch, damit das Fixiermittel vom Objektträger abläuft und in das Papiertuch einzieht. 2x für 15 min bei RT in einem Coplin-Glas mit 50 mL 1x PBS/1% Triton X-100/1% Rinderserumalbumin (PBT/BSA) blocken.
Anmerkung: Für diesen Blockierungsschritt und die in den Abschnitten 6-9 beschriebenen Waschschritte werden Coplin-Dosen oder andere Arten von Färbegläsern empfohlen. Diese bieten ausreichende Volumina für einen effizienten Austausch von Blockier- oder Waschpuffer mit der Probe.
- Blockieren Sie Objektträger mit einer PBT/BSA-Lösung, die 10 % normales Ziegenserum enthält. Wischen Sie vorsichtig die Kanten ab, die den Objektträger umgeben, und tragen Sie 100 μl der Lösung auf den Objektträger auf. 1 h bei RT in einer Feuchtkammer inkubieren.
Anmerkung: Dieser Schritt wird für die Färbung mit dem αFLAG-Primärantikörper dringend empfohlen. Die Feuchtkammer besteht aus Glaspipetten, die mit Klebeband in der Schale befestigt werden, damit die Objektträger während der Inkubation darauf liegen können. Angefeuchtete Arbeitstücher (Materialtabelle) werden in die Schale gelegt, um die innere Luftfeuchtigkeit der Schale zu erhöhen und eine Verdunstung zu verhindern. Der Deckel und das Tablett sind mit Folie abgedeckt, um die Proben während der lichtempfindlichen Schritte vor Licht zu schützen.
- Legen Sie den Objektträger auf ein Papiertuch, damit die PBT/BSA/10%NGS-Lösung vom Objektträger ablaufen kann, und wischen Sie die Ränder des Objektträgers vorsichtig ab. Verwenden Sie das Blockierungsreagenz (Materialtabelle), um Objektträger zu blockieren. Tragen Sie einen Tropfen auf den Abstand von 14 mm x 14 mm auf. Die Objektträger 1 h bei 37 °C in einer Feuchtkammer inkubieren.
5. Inkubation von Primärantikörpern
HINWEIS: Um die besten PLA-Ergebnisse und einen minimalen Hintergrund zu erzielen, muss der Verdünnungsfaktor der primären Antikörper möglicherweise optimiert werden (siehe Diskussion für weitere Details). Darüber hinaus sollten die primären Antikörper in verschiedenen Wirten gezüchtet werden, die der Spezifität der für PLA verwendeten Sekundärantikörper entsprechen.
- Legen Sie den Objektträger auf ein Papiertuch, damit das blockierende Reagenz vom Objektträger ablaufen kann, und wischen Sie die Ränder vorsichtig ab. Verwenden Sie das Antikörperverdünnungsmittel (Materialtabelle), um die Primärantikörper zu verdünnen. Tragen Sie 40 μl Primärantikörperlösung pro 14 mm x 14 mm Raum auf.
- Die Objektträger über Nacht in einer Feuchtkammer bei 4 °C inkubieren.
6. Inkubation der PLA-Sonde (Sekundärantikörper)
HINWEIS: Verwenden Sie für die Schritte 6-9 die Waschpuffer A und B bei RT. Wenn die Puffer bei 4 °C gelagert werden, lassen Sie sie vor der Verwendung auf RT erwärmen.
- Waschen Sie die Objektträger 2x für 5 min mit 50 mL 1x Waschpuffer A (Table of Materials) bei RT in einem Coplin-Glas. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbitalschüttler, der auf 60 U/min eingestellt ist.
- Legen Sie die Folie auf ein Papiertuch, damit der Waschpuffer von der Folie abläuft, und wischen Sie die Ränder vorsichtig ab. Bereiten Sie eine 40-μl-Lösung vor, die PLUS- und MINUS-Sonden enthält (1:5 mit Antikörperverdünnungsmittel verdünnt). Tragen Sie die Lösung auf jeden Raum von 14 mm x 14 mm auf.
- Die Objektträger in einer Feuchtkammer 1 h bei 37 °C inkubieren.
7. Ligation
- Waschen Sie die Objektträger 2x für 5 min mit 50 mL 1x Waschpuffer A bei RT in einem Coplin-Glas. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbitalschüttler, der auf 60 U/min eingestellt ist.
- Verdünnen Sie den Ligationspuffer (Materialtabelle) 1:5 mit Reinstwasser. Verwenden Sie diesen Puffer, um die Ligase (Materialtabelle) 1:40 zu verdünnen, um einen Arbeitsbestand an Ligationslösung herzustellen.
- Legen Sie den Objektträger auf ein Papiertuch, damit der Waschpuffer vom Objektträger ablaufen kann, und wischen Sie die Ränder vorsichtig ab. Tragen Sie 40 μl der Ligaturlösung auf jeden Raum von 14 mm x 14 mm auf.
- Die Objektträger in einer Feuchtkammer 30 Minuten lang bei 37 °C inkubieren.
8. Verstärkung
HINWEIS: Die Verwendung von Nachweisreagenzien mit roten Fluorophoren (Materialtabelle) führt zu der geringsten Menge an Hintergrund im Gewebe von C. elegans.
- Waschen Sie die Objektträger 2x für 5 min mit 50 mL 1x Waschpuffer A bei RT in einem Coplin-Glas. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbitalschüttler, der auf 60 U/min eingestellt ist.
- Verdünnen Sie den roten Amplifikationspuffer (Materialtabelle) 1:5 mit Reinstwasser. Verwenden Sie diesen Puffer, um die Polymerase (Materialtabelle) 1:80 zu verdünnen, um einen Arbeitsbestand an Amplifikationslösung herzustellen und vor Licht zu schützen.
- Legen Sie den Objektträger auf ein Papiertuch, damit der Waschpuffer vom Objektträger ablaufen kann, und wischen Sie die Ränder vorsichtig ab. Tragen Sie 40 μl der Amplifikationslösung auf jeden Raum von 14 mm x 14 mm auf.
- Inkubieren Sie die Objektträger in einer Feuchtkammer für 1 h und 40 min bei 37 °C. Stellen Sie sicher, dass die Feuchtkammer mit Folie abgedeckt ist, um die Proben vor Licht zu schützen.
9. Abschließende Wäschen
- Waschen Sie die Objektträger 2x für 10 min mit 50 mL 1x Waschpuffer B (Table of Materials) bei RT in einem Coplin-Glas. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbitalschüttler, der auf 60 U/min eingestellt ist.
- Waschen Sie die Objektträger 1x für 1 min mit 50 mL 0,01x Waschpuffer B bei RT in einem Coplin-Glas. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbitalschüttler, der auf 60 U/min eingestellt ist. Dieser Puffer wird hergestellt, indem Waschpuffer B mit Reinstwasser verdünnt wird.
10. Deckglas-Montage
- Lassen Sie den überschüssigen Waschpuffer von der Folie auf ein Papiertuch ablaufen und wischen Sie alle verbleibenden Pufferreste auf dem epoxidbeschichteten Umfang der Folie ab.
- Geben Sie 10 μl Eindeckmedium (Materialtabelle) zur Probe und legen Sie vorsichtig ein Deckglas darauf, damit sich das Eindeckmedium ausbreiten kann.
- Malen Sie den Rand des Deckglases mit Nagellack an, um das Deckglas und den Gleiter zu versiegeln. Seien Sie vorsichtig beim Auftragen von Nagellack, um zu vermeiden, dass das Deckglas verschoben wird, wodurch die Keimbahnen beschädigt werden. Lassen Sie den Nagellack mindestens 20 min bei RT aushärten, während die Objektträger vor Licht geschützt sind, bevor Sie ihn unter dem Mikroskop betrachten.
