1. Immunpräzipitation
HINWEIS: Wir haben Lysepuffer und Citrat-Elution ohne Natriumdodecylsulfat (SDS) verwendet, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben. Die Verwendung einer alternativen hauseigenen Immunpräzipitationstechnik kann jedoch auch für die Vorbereitung von LC-MS/MS-Proben anwendbar sein.
- Transfizieren Sie kultivierte Zellen mit Vektoren, die für einen Epitop-Tag allein oder ein Fusionsprotein kodieren. Um repräsentative Daten zu erhalten, werden J774-Zellen (1 x 106) mit Vektoren, die nur für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodieren, oder GFP-fusioniertes Capn6 (Calpain-6-Gen) unter Verwendung kationischer Liposomen übertragen.
- Konjugieren Sie den Antikörper an magnetische Kügelchen.
- Zu diesem Zweck wird der Anti-GFP-Antikörper (2 μl/Reaktion) mit magnetischen Kügelchen (25 μl/Reaktion) in 500 μl Citratphosphatpuffer (24,5 mM Zitronensäure, 51,7 mM zweibasisches Natriumphosphat; pH 5,0) in einem 1,5 mL Reagenzglas gemischt.
- Drehen Sie die Mischung 1 h lang bei Raumtemperatur bei 50 U/min. Waschen Sie dann die IgG-konjugierten Kügelchen dreimal mit Citratphosphatpuffer, der 0,1 % Polyoxyethylen (20)-Sorbitanmonolaurat enthält.
- Lysieren Sie die transfizierten Zellen mit einem geeigneten Lysepuffer. Um repräsentative Daten zu erhalten, lysieren Sie die transfizierten Zellen 30 Minuten lang auf Eis in 400 μl Lysepuffer (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5 % Poly(oxyethelen)octylphenylether) mit 40 μmol/l Phenylmethylsulfonylfluorid, 50 μg/ml Leupeptin, 50 μg/ml Aprotinin, 200 μmol/l Natriumorthovanadat, und 1 mM Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) in 1,5 mL Reagenzgläsern 24 h nach der Transfektion.
- Das Lysat wird durch Zentrifugieren bei 15.000 x g für 5 min gereinigt und der Überstand wird aufgefangen.
- Reinigen Sie das Lysat vor. Geben Sie unmarkierte magnetische Kügelchen (25 μL/Reaktion) in ein 1,5 mL-Reagenzglas. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 500 μl Citratphosphatpuffer. Nach der Entfernung des Citratphosphatpuffers in der letzten Wäsche geben Sie das Zelllysat über die Magnetkügelchen. Drehen Sie die Mischung mit einem Rotator bei 50 U/min für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
- Stellen Sie das Reagenzglas für 5 Minuten zur magnetischen Trennung auf einen Magnetständer und sammeln Sie das Zelllysat. Es wird empfohlen, den vom Hersteller angegebenen Magnetständer zu verwenden.
- Binden Sie die Zielproteine an die konjugierten Kügelchen. Legen Sie die Immunglobulin (Ig)G-konjugierten Kügelchen für 5 Minuten zur magnetischen Trennung auf einen Magnetständer, verwerfen Sie den Citratpuffer und fügen Sie dann das Zelllysat zu den getrennten Kügelchen hinzu.
- Drehen Sie die Mischung 1 h lang bei Raumtemperatur bei 50 U/min.
- Trennen Sie die Zielproteine von den freien Nichtzielproteinen. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 500 μl Citratphosphatpuffer mit 0,1 % Polyoxyethylen (20)-Sorbitanmonolaurat. Nach der letzten Wäsche 30 μl Citratpuffer (pH 2–3) zugeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die Zielproteine zu eluieren.
Anmerkung: Wenn die Erholung von der Immunpräzipitation unzureichend ist, kann die Verwendung alternativer Epitop-Tags wie FLAG oder KIS die Effizienz verbessern. Wenn die Effizienz der Elution nicht ausreicht, kann die Verwendung anderer Eluantien, wie z. B. einer SDS-basierten Lösung, die Effizienz verbessern.
2. On-Membran-Verdau von Proteinen
HINWEIS: Die Verwendung von proteinfreien Materialien und Geräten ist notwendig, um eine Kontamination mit exogenen Proteinen zu vermeiden. Darüber hinaus wird empfohlen, dass der Bediener eine chirurgische Maske und Handschuhe trägt, um eine Kontamination durch menschliche Proteine zu vermeiden.
- Schneiden Sie PVDF-Membranen mit einer chirurgischen Schere, die unmittelbar vor der Verwendung mit Methanol abgewischt und getrocknet wurde, in 3 mm x 3 mm große Stücke.
- Fügen Sie 2–5 μl Ethanol zu den Stücken der PVDF-Membran auf sauberer Aluminiumfolie hinzu.
- Bevor sie vollständig trocknen, geben Sie das Eluant (je 2–5 μl, 4–6 Stück pro Probe) auf die hydrophilen PVDF-Membranen und trocknen Sie die Membranen dann an der Luft, bis die Membranoberfläche matt wird. Getrocknete Membranen können bei 4 °C gelagert werden.
- Übertragen Sie alle Membranen in 1,5-ml-Kunststoffröhrchen, fügen Sie 20–30 μl Ethanol hinzu, um die Membranen hydrophil zu machen, und entfernen Sie dann das Ethanol mit einer Pipette.
- Bevor die Membran vollständig austrocknet, fügen Sie 200 μl Reaktionslösung auf Dithiothreitol (DTT)-Basis (80 mM NH4HCO3, 10 mM DTT und 20 % Acetonitril) hinzu und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 56 °C.
- Die Reaktionslösung wird durch 300 μl Jodacetamidlösung (80 mM NH4HCO3, 55 mM Jodacetamid und 20 % Acetonitril) ersetzt und 45 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.
- Waschen Sie die Membranen zweimal mit 1 mL destilliertem Wasser und einmal mit 1 mL 2% Acetonitril durch Vortex-Mischen für >10 s.
- Lösen Sie lyophilisiertes Trypsin in MS-Qualität (Materialtabelle) direkt in der Reaktionslösung (30 mM NH4HCO3 mit 70 % Acetonitril). 100 μl der Reaktionslösung mit 1 μg Trypsin (Materialtabelle) (30 mM NH4HCO3 mit 70 % Acetonitril) zugeben und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Die Reaktionslösung, die die tryptischen Aufschlüsse enthält, wird mit einer Pipette in ein sauberes 1,5-ml-Reagenzglas überführt.
- 100 μl Waschlösung (70 % Acetonitril/1 % Trifluoressigsäure) auf die Membran geben und 2 h bei 60 °C inkubieren. Die Waschlösung auffangen und mit der Reaktionslösung mischen. Geben Sie weitere 100 μl Waschlösung in die Membran und beschallen Sie sie 10 Minuten lang. Sammeln Sie dann die Waschlösung und mischen Sie sie mit der Reaktionslösung.
- Decken Sie das Reagenzglas mit einem Stück Laborfolie ab und stechen Sie mit einer Nadel ein paar kleine Löcher. Trocknen Sie die Lösung mit einem Vakuumkonzentrator.
- Lösen Sie den Rückstand in 10 μl 0,2 % Ameisensäure auf. Nach der Zentrifugation (12.000 × g, 3 min bei Raumtemperatur) wird der Überstand in ein Probenröhrchen überführt.
Anmerkung: Die Waschungen sind die kritischen Schritte dieses Abschnitts. Während der Proteinverdauung auf der Membran ist das Waschen der Membranen, die die immobilisierten Proteine enthalten, nach der Reduktion und Alkylierung mit destilliertem Wasser, gefolgt von 2 % Acetonitril, für jeweils mehr als 10 Sekunden, entscheidend für die Entfernung der Reagenzien.
