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1. Biosensor-Hydratation und Assay-Aufbau
- Schalten Sie die BLItz-Maschine ein.
- Stellen Sie sicher, dass das Gerät über einen USB-Datenausgang an der Rückseite des Geräts mit dem Computer verbunden ist.
- Öffnen Sie auf dem Computer die zugehörige Software (z. B. BLItz Pro) und klicken Sie auf Advanced Kinetics auf der linken Seite des Bildschirms.
- Geben Sie in der Software alle relevanten Informationen über das Experiment (einschließlich des Experimentnamens, der Beschreibung, der Proben-ID und der Proteinkonzentration) unter der jeweiligen Überschrift ein.
- Klicken Sie auf Biosensortyp und wählen Sie Ni-NTA aus dem Dropdown-Menü.
- Überprüfen Sie unter der Überschrift Ausführungseinstellungen, ob der Shaker auf Aktivieren festgelegt ist.
- Überprüfen Sie, ob unter der Überschrift Liste der Schritttypen 5 Elemente aufgeführt sind: Initial Baseline, Loading, Baseline, Association und Dissociation.
Anmerkung: Die Dauer jedes Schritts kann bei Bedarf von der Standarddauer geändert werden. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie mindestens 30 s für Initial Baseline und Baseline. und 120 s für Assoziation und Dissoziation. Die Dauer des Ladeschritts (von 120 bis 240 s) hängt von der Konzentration des Liganden und der Affinität des His-Epitop-Tags auf dem Liganden zum Ni-NTA-Biosensor ab.
- Entfernen Sie den hydratisierten Ni-NTA-Biosensor aus dem PCR-Röhrchen und befestigen Sie ihn an der Biosensorhalterung an der Maschine, indem Sie den breiten Teil des Biosensors auf die Halterung schieben.
Anmerkung: Lassen Sie den Biosensor während des Experiments nicht austrocknen.
- Setzen Sie ein schwarzes 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in den Röhrchenhalter der Maschine ein und pipettieren Sie 400 μl des BLI-Puffers hinein.
- Vergewissern Sie sich, dass der Schieberegler der Maschine so positioniert ist, dass sich der Schlauchhalter vor dem schwarzen Pfeil an der Maschine befindet.
- Schließen Sie die Abdeckung der Maschine so, dass die Biosensorspitze in den Puffer im Mikrozentrifugenröhrchen eintaucht.
- Klicken Sie in der Software auf Weiter, um mit der Aufzeichnung der Initial Baseline zu beginnen.
2. Laden des Liganden auf den Biosensor
- Nachdem der Schritt "Initial Baseline" die Aufzeichnung beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung des Geräts.
- Schieben Sie den Schieberegler nach rechts, so dass sich der Tropfenhalter (anstelle des Röhrenhalters) vor dem schwarzen Pfeil befindet.
- Pipettieren Sie 4 μl eines dialysierten His-markierten Liganden auf den Tropfenhalter und schließen Sie die Abdeckung des Geräts.
HINWEIS: Die optimale Konzentration des zu verwendenden Liganden kann für jedes Protein variieren. Eine Konzentration zwischen 1,0 und 2,0 mg/mL ist in der Regel ausreichend, um das NTA an der Spitze des Biosensors in 240 s zu sättigen.
- Klicken Sie in der Software auf Weiter, um mit dem Laden zu beginnen.
3. Zusätzlichen Liganden wegspülen
- Nachdem der Ladeschritt abgeschlossen ist, öffnen Sie die Abdeckung des Geräts.
- Schieben Sie den Schieberegler nach links, so dass sich der Röhrenhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet.
- Schließen Sie den Deckel der Maschine und stellen Sie sicher, dass die Biosensorspitze in den BLI-Puffer des Röhrchens im Röhrchenhalter eingetaucht ist.
- Klicken Sie in der Software erneut auf Weiter, um mit der Aufzeichnung der Baseline zu beginnen.
4. Assoziation von Analyt und Ligand
- Nachdem der Schritt "Baseline" die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung des Geräts.
- Entfernen Sie den Tropfenhalter und reinigen Sie ihn, indem Sie das Protein herauspipettieren und insgesamt 5 Mal mit doppelt deionisiertem Wasser (ddH2O) spülen.
- Verwenden Sie ein Taschentuch, um die Oberfläche des Tropfenhalters nach dem Waschen zu reinigen.
- Setzen Sie den Tropfenhalter wieder auf die Maschine ein.
- Schieben Sie den Schieberegler an der Maschine nach rechts, so dass sich der Fallhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet.
- Pipettieren Sie 4 μl eines dialysierten Analyten auf den Tropfenhalter und schließen Sie die Abdeckung des Geräts.
- Klicken Sie in der Software auf Weiter, um die Zuordnung zu starten.
5. Dissoziation des Analyten vom Liganden
- Nachdem der Zuordnungsschritt die Aufnahme abgeschlossen hat, öffnen Sie die Abdeckung des Geräts.
- Schieben Sie den Schieberegler an der Maschine nach rechts, so dass sich der Schlauchhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet.
- Klicken Sie in der Software auf Weiter, um die Dissoziation zu starten.
- Nachdem der Dissoziationsschritt die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung des Geräts.
- Entfernen Sie den Tropfenhalter und den Röhrenhalter.
- Spülen Sie beide gründlich mit ddH2O ab, um jegliches Eiweiß wegzuspülen.
- Entfernen Sie den Biosensor und entsorgen Sie ihn sicher.