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1. Probenvorbereitung: Zell-Zell-Mischassay
HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt das Mischverfahren für adhärente Zellen. Es kann für Zellen, die in Suspension kultiviert werden, modifiziert werden.
- Säen Sie einen Tag vor der Transfektion eine angemessene Anzahl von Zellen auf einer 6-Well-Platte, z. B. 800.000 HEK 293T-Zellen (gezählt mit einer Neubauer-Zählkammer). Die Anzahl kann je nach Zeit zwischen Aussaat und Transfektion modifiziert und für andere Zelltypen angepasst werden. Um ein grundlegendes Experiment durchzuführen (d. h. Proteine von Interesse und Negativkontrolle), bereiten Sie mindestens 4 Vertiefungen vor. Kultivierung von Zellen bei 37 °C, 5 % CO2 in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Medium, ergänzt mit fötalem Rinderserum (10 %) und L-Glutamin (1 %).
- Transfizieren Sie die Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
- Um ein Basisexperiment durchzuführen, transfizieren Sie in separaten Vertiefungen Plasmide für das Protein von Interesse, die mit einem "grünen" (z. B. monomeren verstärkten grünen fluoreszierenden Protein (mEGFP) oder gelb fluoreszierendem Protein (mEYFP)) oder "rotem" (z. B. mCherry oder mCardinal) fluoreszierendem Protein fusioniert sind
Anmerkung: In diesem Protokoll konzentrieren wir uns auf APLP1-mEYFP und APLP1-mCardinal und die entsprechenden Negativkontrollen, z.B. myristoyliert-palmitoyliert-mEYFP (myr-palm-mEYFP) und -mCardinal (myr-palm-mCardinal). Im Allgemeinen sind 200 ng - 1 μg Plasmid-DNA ausreichend. Eine hohe Transfektionseffizienz erhöht die Chance, "rote" und "grüne" Zellen in Kontakt zu finden. Ändern Sie die Menge an Plasmid und Transfektionsreagenz, um die Transfektionseffizienz zu optimieren. Kritisch: Die Zellkonfluenz sollte bei der Transfektion der Zellen bei etwa 70 % liegen. Wenn die Zellen überkonfluent sind, nimmt die Transfektionseffizienz ab. Wenn die Zellen nicht konfluent genug sind, können Transfektion und Mischen Stress auslösen und viele Zellen daran hindern, sich nach dem Mischen richtig zu verbinden.
- Führen Sie die Zellmischung ~4 ± 2 h nach der Transfektion durch.
- Entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie jede gut vorsichtig mit 1 ml PBS, ergänzt mit Mg2+ und Ca2+. Entfernen Sie dann das PBS. (Kritisch) Lassen Sie PBS auf den Rand der Vertiefung fallen, um eine Ablösung der Zellen während des Waschens zu verhindern.
- Geben Sie ~50 μl Trypsinethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung tropfenweise in jede Vertiefung, um die Ablösung der Zellen zu erleichtern. Bei 37 °C 2 min inkubieren. Schütteln Sie anschließend die 6-Well-Platte langsam seitlich, um die Zellen zu lösen.
Anmerkung: Für einige Zelltypen können verlängerte Inkubationszeiten erforderlich sein.
- Geben Sie 950 μl Wachstumsmedium in jede Vertiefung und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie einige Male auf und ab pipettieren, wodurch sich alle Zellen vom Vertiefungsboden lösen. (Kritisch) Stellen Sie sicher, dass die Zellen ordnungsgemäß resuspendiert und voneinander getrennt werden, indem Sie visuell überprüfen, ob nach der Resuspension keine großen Zellaggregate vorhanden sind. Andernfalls erhalten Sie nach dem Mischen viele 'rote'-'rote' oder 'grün'-'grüne' Kontakte.
- Übertragen Sie die Zelllösung einer Vertiefung (Protein von Interesse oder Negativkontrolle) in die entsprechende Vertiefung, d. h. "rote" (z. B. APLP1-mCardinal transfizierte) auf "grüne" (z. B. APLP1-mEYFP transfizierte) Zellen. Mischen Sie, indem Sie ein paar Mal vorsichtig auf und ab pipettieren. Anschließend werden die gemischten Zellen auf 35-mm-Glasbodenschalen (1 ml gemischte Zelllösung pro Schale, plus 1 ml Wachstumsmedium) ausgesät und die ausgesäten Zellen für einen weiteren Tag bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.
2. Probenvorbereitung: Positivkontrolle für Kreuzkorrelationsexperimente und Homo-Dimer-Konstrukt für die Helligkeitsanalyse
- Einen Tag vor der Transfektion wurden 600.000 HEK 293T-Zellen, gezählt mit einer Zellzählkammer, auf 35-mm-Glasbodenschalen gesät. Die Zellen werden einen weiteren Tag lang bei 37 °C, 5 % CO2 in einem vollständigen DMEM-Medium (siehe Schritt 1.1) kultiviert.
- Transfizieren Sie Zellen mit ~250 ng Plasmid-DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für die positive Kreuzkorrelationskontrolle wird ein Plasmid verwendet, das für ein membranverankertes fluoreszierendes Protein-Heterodimer kodiert, z. B. myr-palm-mCherry-mEGFP oder myr-palm-mCardinal-mEYFP, das den FPs des interessierenden Proteins entspricht. Verwenden Sie für die Helligkeitskalibrierung Plasmide, die sowohl für ein membranverankertes FP-Monomer als auch für ein Homo-Dimer kodieren, die den FPs entsprechen, die mit dem interessierenden Protein fusioniert sind, z. B. myr-palm-mEYFP und myr-palm-mEYFP-mEYFP, um die Helligkeitsanalyse von APLP1-mEYFP zu kalibrieren.
- Kultur der Zellen bei 37 °C, 5 % CO2 in vollständigem DMEM-Medium (siehe Schritt 1.1) für einen weiteren Tag.
3. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie: Aufbau und Kalibrierung des Fokusvolumens
HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde für Experimente geschrieben, die mit mEGFP/mEYFP und mCherry/mCardinal auf dem in dieser Studie verwendeten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt wurden. Der optische Aufbau, die Softwareeinstellungen (Laserlinien, dichroitische Spiegel, Filter) und die Wahl der Kalibrierfarbstoffe können für andere FPs und Mikroskop-Setups geändert werden.
- Schalten Sie das Mikroskop und die Laser mindestens eine Stunde vor dem Experiment ein, um die Stabilität des Lasers und den Temperaturausgleich sicherzustellen.
- Bereiten Sie 100-200 μl geeigneter wasserlöslicher Fluoreszenzfarbstofflösungen (Beispiele siehe Materialtabelle für Beispiele) in Wasser oder PBS vor, um das Fokusvolumen mit Konzentrationen im Bereich von 10-50 nM zu kalibrieren.
- Die Färbelösungen werden auf eine saubere 35-mm-Glasbodenschale #1,5 gegeben, d.h. mit einer Dicke von 0,16-0,19 mm.
Anmerkung: Idealerweise verwenden Sie Schalen mit Hochleistungs-Deckglas mit einer geringen Dickentoleranz, z. B. 0,170 ± 0,005 mm, um eine optimale Kragenringkorrektur zu ermöglichen (Schritt 3.6). Es ist wichtig, die gleiche Art von Schale zu verwenden, die später für die folgenden Experimente verwendet wird.
- Die Schale, die die Färbelösung enthält, wird direkt auf das Objektiv gestellt (vorzugsweise durch Eintauchen in Wasser, mit NA 1.2), um eine Fokussierung in die Lösung zu gewährleisten. Alternativ können Sie die Schale auf den Probenhalter stellen und in die Probe fokussieren (z. B. 10-20 μm über dem Boden der Schale).
HINWEIS: Wir empfehlen die Verwendung von Ölobjektiven nicht, da das Signal bei der Fokussierung tief in wässrige Proben schlecht ist.
- Stellen Sie den Anregungs- und Emissionspfad ein, z. B. wählen Sie den 488-nm-Laser, einen dichroitischen Spiegel mit 488/561 nm, ein Detektionsfenster von 499-552 nm und eine Lochblendengröße von 1 Airy-Einheit (AU). Stellen Sie sicher, dass die Lochblendengröße mit der Größe übereinstimmt, die bei Kreuzkorrelationsmessungen verwendet wird.
- Passen Sie die Position der Lochblende (Lochverstellung) und den Objektivring an, um die Zählrate zu maximieren. Drehen Sie zu diesem Zweck den Kragenring, bis die maximale Zählrate erkannt wird.
Anmerkung: Die Kragenringkorrektur berücksichtigt die spezifische Dicke des verwendeten Deckglases. Die Maximierung der Zählrate, d.h. das Sammeln von so vielen Photonen pro Molekül wie möglich, ist entscheidend, um das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) der Messungen zu maximieren.
- Führen Sie eine Reihe von Punkt-FCS-Messungen (z. B. 6 Messungen an verschiedenen Orten, die jeweils aus 15 Wiederholungen von 10 s bestehen, d. h. 2,5 Minuten Gesamtzeit, abgetastet mit 1 μs Verweilzeit oder weniger) bei der gleichen Laserleistung durch, die bei Kreuzkorrelationsmessungen verwendet wird (typischerweise ~1 %, d. h. ~1-2 μW).
- Passen Sie ein dreidimensionales Diffusionsmodell mit einem Triplett-Beitrag (Gleichung 1) an die Daten an.
Anmerkung: Typischerweise liegen die erhaltenen Diffusionszeiten bei etwa 30 μs und der Strukturfaktor bei etwa 4-8.
- Berechnen Sie die Taille w0 aus der gemessenen durchschnittlichen Diffusionszeit und den veröffentlichten Werten für den Diffusionskoeffizienten des verwendeten Farbstoffs bei Raumtemperatur gemäß Gleichung 2.
Typische Werte liegen bei 200-250 nm.
- Wiederholen Sie die Kalibrierungsroutine (Schritte 3.4-3.9) bei Bedarf mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff für einen zweiten Detektionskanal (z. B. 561 nm Anregung und Detektion zwischen 570 nm und 695 nm). Behalten Sie die Position und Größe der Lochblende bei, wie sie für den ersten Erkennungskanal eingestellt wurde.
- Berechnen Sie die molekulare Helligkeit (Gleichung 3) aus den Kalibrierungsmessungen und speichern Sie die erhaltenen Werte.
Anmerkung: Typische Werte für den verwendeten Aufbau sind ~8-10 kHz/Molekül (MOL) für 1,8 μW 488 nm Anregungsleistung. Niedrigere Werte als üblich können auf Schmutz auf dem Objektiv, eine Fehlausrichtung des Setups oder eine verringerte Laserleistung hinweisen. Überprüfen und speichern Sie die Laserausgangsleistungen am Objektiv regelmäßig mit einem Leistungsmesser. Für den Vergleich verschiedener Aufbauten ist die molekulare Helligkeit, die durch die Anregungslaserleistung normiert wird, der aussagekräftigste Parameter zur Beurteilung der Mikroskopleistung.
4. Rasterfluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie: Erfassung
HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde für Experimente geschrieben, die mit mEGFP/mEYFP ('grün') und mCherry/mCardinal ('rot') auf dem in dieser Studie verwendeten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt wurden. Der optische Aufbau und die Softwareeinstellungen (Laserlinien, dichroitische Spiegel, Filter) können für andere FPs oder Mikroskop-Setups unterschiedlich sein.
- Richten Sie den Strahlengang ein, z. B. 488 nm und 561 nm Anregung und einen dichroitischen 488/561 nm Spiegel, Lochblende auf 1 AU für 488 nm Anregung. Um spektrales Übersprechen zu vermeiden, wählen Sie zwei separate Spuren, um mEGFP/mEYFP (488 nm Anregung, grüner Kanal) und mCherry/mCardinal (561 nm Anregung, roter Kanal) nacheinander zu erregen und zu detektieren, und wählen Sie in jeder Zeile die Schaltspuren aus. Für die Detektion verwenden Sie für beide Kanäle geeignete Filter, z.B. 499-552 nm im grünen Kanal und 570-695 nm im roten Kanal.
- Wenn eine abwechselnde Anregung nicht möglich ist, verwenden Sie geeignete Filtereinstellungen für den roten Kanal, um spektrales Übersprechen zu minimieren (d. h. mCherry/mCardinal-Fluoreszenz nicht unter 600 nm detektieren). Dies kann die Menge der im roten Kanal detektierten Photonen reduzieren und somit das SNR verringern.
- Stellen Sie die Schale mit den gemischten Zellen auf den Probenhalter. Warten Sie mindestens 10 Minuten, um den Temperaturausgleich sicherzustellen und die Fokusdrift zu reduzieren.
- Fokussieren Sie die Zellen mit der Transmissionsleuchte im Menü "Lokalisieren".
- Suchen Sie nach einem Paar "roter" und einer "grünen" Zelle, die miteinander in Kontakt stehen. Für die positive Kreuzkorrelation oder Homo-Dimer-Helligkeitskontrolle (siehe Abschnitt 2) suchen Sie nach einer isolierten Zelle, die Fluoreszenz in beiden Kanälen emittiert, oder nach dem jeweiligen Homo-Dimer-Signal an der PM.
HINWEIS: (Kritisch) Minimieren Sie die Probenexposition bei der Suche nach Zellen, um ein Vorbleichen zu vermeiden, das die Kreuzkorrelation verringern kann. Scannen Sie daher mit der schnellsten Scangeschwindigkeit und mit geringer Laserleistung. Um eine Detektorsättigung bei der Abbildung stark exprimierender Zellen zu vermeiden, suchen Sie im Integrationsmodus. Um die Belichtung zu minimieren, ist jedoch das Scannen mit niedrigeren Laserleistungen im Photonenzählmodus möglich.
- Wählen Sie mit der Schaltfläche Zuschneiden einen Scanpfad senkrecht zum Zell-Zell-Kontakt (oder zum PM einer einzelnen Zelle für die positive Kreuzkorrelation oder die Homo-Dimer-Helligkeitssteuerung), wie in den Abbildungen 1B und 2A dargestellt.
Anmerkung: Einige ältere Mikroskope erlauben keine willkürlichen Scanrichtungen. In diesem Fall müssen Zell-Zell-Kontakte mit einer Orientierung senkrecht zur Scanrichtung lokalisiert werden.
- Zoomen Sie, um eine Pixelgröße von 50-200 nm zu erreichen, und wählen Sie Linie im Scan-Modus. Legen Sie die Framegröße auf 128 × 1 Pixel fest.
Anmerkung: Die typische Pixelgröße beträgt 160 nm, was einer Scanlänge von etwa 20 μm entspricht.
- Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf den maximal zulässigen Wert ein, z. B. 472,73 μs pro Zeile.
Anmerkung: Für ein alternatives Anregungsschema entspricht dies einer Scanzeit von 954,45 μs, d.h. ~1000 Scans/s auf dem verwendeten Setup. Die Scangeschwindigkeit kann in Abhängigkeit vom Diffusionskoeffizienten des interessierenden Proteins angepasst werden. Für membranverankerte Proteine liegen die typischen Diffusionszeiten bei etwa 10-20 ms. Die Scanzeit sollte mindestens zehnmal kleiner sein als die Diffusionszeiten. Niedrigere Scangeschwindigkeiten können zu einem stärkeren Photobleaching führen und erfordern eine geringere Beleuchtungsleistung. Alternativ kann man eine Pause, z.B. 5 ms, zwischen jedem Scan für sehr langsam diffundierende Komplexe mit Intervall im Untermenü Zeitreihe einlegen.
- Wählen Sie die passenden Laserleistungen, z.B. ~1-2 μW für 488 nm und ~5-10 μW für 561 nm Anregung.
Anmerkung: Höhere Laserleistungen verbessern das SNR, erhöhen aber das Photobleaching. Daher sollten die Laserleistungen so gewählt werden, dass das Photobleaching weniger als 50 % der anfänglichen Zählrate beträgt.
- Zyklen auf 100.000-500.000,
setzen
Anmerkung: Die Anzahl der Scans, d.h. die Dauer der Messung, kann variieren: Längere Messzeiten verbessern das SNR und sind möglicherweise besser für langsam diffundierende Moleküle geeignet, jedoch begrenzen die Bewegung der Zellen und das Photobleaching die maximale Messzeit. Die hier vorgestellten Daten wurden routinemäßig für ~3-6 Minuten erfasst, d.h. 200.000-400.000 Zeilenscans.
- Stellen Sie die Detektoren auf den Photonenzählmodus ein. Drücken Sie auf Experiment starten, um die Erfassung zu starten. Wiederholen Sie die Schritte 4.5-4.11, um eine weitere Zelle zu messen.
Anmerkung: Es wird empfohlen, 10-15 Zellen pro Probe bei unterschiedlichen Expressionsniveaus zu messen. (Kritisch) Vermeiden Sie eine Detektorsättigung bei hohen Expressionspegeln. Die maximale Zählrate sollte ~1 MHz nicht überschreiten.
- Wenn eine Helligkeitsanalyse durchgeführt wird, um oligomere Zustände zu bestimmen, sind Kalibrierungsmessungen der Homo-Dimer-Helligkeit gemäß den modifizierten Schritten 4.1-4.11 durchzuführen: Jedes fluoreszierende Protein-Homo-Dimer wird separat gemessen (in isolierten Zellen, die unter Verwendung von Protokollabschnitt 2 hergestellt wurden) und Messungen werden nur in einem Spektralkanal durchgeführt.
