Immunpräzipitationsassay zur Untersuchung von Enzymrezeptor-Wechselwirkungen in transfizierten Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Strazza, M., et al. Co-Immunpräzipitations-Assay zur Untersuchung funktioneller Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen. J. Vis. Exp. (2018).

In diesem Video demonstrieren wir eine Technik zur Durchführung der Co-Immunpräzipitation von GFP-markierten Wildtyp- und mutierten PD-1-Proteinen unter Verwendung von Kügelchen, die mit Anti-GFP-Antikörpern beschichtet sind. Die beadgebundenen PD-1-GFP-Proteine werden mit SHP2-Proteinen inkubiert, die mit PD-1 interagieren, was die Identifizierung spezifischer Strukturmotive in PD-1 ermöglicht, die eine entscheidende Rolle bei der SHP2-Interaktion spielen.

Protokoll

1. Immunpräzipitation

HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten auf Eis oder bei 4 °C durchgeführt werden.

1. Ergänzen Sie den Lysepuffer (50 mM Tris-HCl bei pH 7,2, 250 mM NaCl, 0,1 % NP-40, 2 mM EDTA, 10 % Glycerin) mit Proteaseinhibitoren (1 Tablette in 10 mL Lysepuffer auflösen) und mit 1 mM Natriumorthovanadat. Geben Sie 500 μl eiskalten Lysepuffer zu den Zellen und entnehmen und sammeln Sie die Zellen sofort mit einem Zellschaber von den Platten.
   Anmerkung: Es ist wichtig, das Natriumorthovanadat nur zu dem Lysepuffer hinzuzufügen, der für die PD-1-GFP-transfizierten Platten verwendet wird, da die SHP2-transfizierten Platten und die nicht transfizierten Kontrollplatten die Phosphataseaktivität beibehalten müssen.
2. Übertragen Sie die Lysate in 1,5 mL kalte Röhrchen und drehen Sie sie 30 min lang bei 0,005 x g, 4 °C.
3. Um den Nachkernüberstand (PNS) aus den Lysaten zu gewinnen, schleudern Sie die Lysate 10 Minuten lang bei 10.000 x g bei 4 °C herunter und überführen Sie die Überstände in neue Röhrchen. Entsorgen Sie das Pellet. Lagern Sie die Überstände des zweiten Satzes von sechs Platten (Abbildung 1) auf Eis für eine spätere Ganzzelllysatanalyse.
4. Präparation der Anti-GFP-Kügelchen für die Immunpräzipitation von PD-1-GFP aus den PD-1-GFP-transfizierten Lysaten des ersten Sets (vier Platten) (Abbildung 1).
   1. Um ein Absetzen der Kügelchen zu verhindern, schütteln Sie die Flasche mit den Kügelchen vor dem Öffnen vorsichtig. Entfernen Sie 40 μl der Anti-GFP-Kügelchen aus der Aufschlämmung für jede Bedingung.
   2. Bei 500 x g 3 min bei 4 °C schleudern und den Überstand entfernen, um die Kügelchen zu waschen.
      Anmerkung: Es ist wichtig, den Kontakt zwischen den Kunststoffspitzen der Pipette und den Agarosekügelchen zu minimieren, um Verluste zu vermeiden. Es wird empfohlen, den Rand einer 200-μl-Spitze abzuschneiden, bevor die Kügelchen in ein anderes Röhrchen umgefüllt werden.
   3. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 80 μl Lysepuffer (pro Probe).
5. Geben Sie die gewaschenen Kügelchen direkt in das Zelllysat (PNS) aus den PD-1-GFP-exprimierenden Zellen des ersten Satzes (vier Platten) (Schritt 1.3). Drehen Sie bei 0,005 x g für 30 min bei 4 °C, um die GFP-markierten Proteine immunauszufällen.
6. Waschen Sie die Kügelchen 3 Mal mit 1 mL Kaltlysepuffer (ohne Orthovanadat). Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2.500 x g für 10 s.
   Anmerkung: Wenn Sie den Lysepuffer zu den Kügelchen hinzufügen, geben Sie ihn direkt auf die Kügelchen, ohne sie mit den Spitzen zu berühren. Es ist nicht erforderlich, während der Spülgänge auf und ab zu pipettieren.
7. Teilen Sie das Lysat des aktiven SHP2 aus dem ersten Satz (eine Platte; Schritt 1.3) und geben Sie es in drei Röhrchen mit den gewaschenen PD-1-GFP-haltigen Kügelchen (dem WT PD-1-GFP und den beiden verschiedenen phospho-defizienten Mutationen, Y223F und Y248F). Geben Sie ein Drittel des Volumens aus dem Lysat der nicht transfizierten Zellen in das zweite Röhrchen der WT PD-1-GFP-Kügelchen. Die restlichen zwei Drittel werden verworfen.
8. Inkubieren Sie die Kügelchen 4 h lang bei 4 °C mit sanfter Drehung (0,005 x g).
9. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 1 ml Kaltlysepuffer (ohne Pervanadat oder Orthovanadat), wie in Schritt 1.6 beschrieben.
10. Geben Sie 80 μl Lysepuffer (ohne Pervanadat oder Orthovanadat) pro Probe hinzu und stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen in jedem Röhrchen 100 μl (20 μl Kügelchen und 80 μl Lysepuffer) beträgt. Vorsichtig mischen und 50 μl aus jedem Röhrchen in zwei frische 1,5 ml-Röhrchen umfüllen.
    Anmerkung: Nach diesem Schritt gibt es zwei Röhrchen, die mit einer Mischung gefüllt sind, die Kügelchen und Lysepuffer enthält. Eines der Röhrchen wird für die Testung des co-immunpräzipitierten SHP2 mittels Western Blot verwendet.

2. SHP2 Western Blot Analyse

1. Schleudere die Perlen herunter und entferne den Überstand.
2. 20 μL 2x Laemmli Puffer (siehe Materialtabelle) zu den Kügelchen geben und bei 95 °C 5 min kochen lassen.
3. Messen Sie die Proteinkonzentration der Eingangskontrollen (zweiter Satz) mit einem BCA-Kit (siehe Materialtabelle). 30 μl der am stärksten verdünnten Probe werden in ein neues Röhrchen umgefüllt. Die restlichen Eingangskontrollen werden mit Lysepuffer auf die gleiche Konzentration wie die am stärksten verdünnte Probe verdünnt und jeweils 30 μl in ein neues Röhrchen überführt.
   Anmerkung: Nach diesem Schritt gibt es 4 Röhrchen mit je 30 μl bei ähnlichen Proteinkonzentrationen, die die Eingangskontrolllysate darstellen.
4. Geben Sie gleiche Volumina von 2x Laemmli-Puffer zu den Lysaten und kochen Sie sie 5 Minuten lang bei 95 °C. Schleudern Sie die Kügelchen herunter und laden Sie den Überstand auf 4–20% SDS-PAGE Tris-basiertes Gel (siehe Materialtabelle) für die Western-Blot-Analyse. Laden Sie zusätzlich 50 μl aus jeder Probe des zweiten Sets.
5. Fahren Sie mit der Western-Blot-Analyse fort.

Ergebnisse

Abbildung 1: Versuchsbedingungen und Strategie. GFP-PD-1 WT (Wildtyp), GFP-PD-1 Y223F (ITIM-Mutante) oder GFP-PD-1 Y248F (ITSM-Mutante) wurden in HEK 293T-Zellen exprimiert, die anschließend mit Pervanadat behandelt wurden. Phosphorylierte GFP-PD-1-Proteine, die durch GFP-Immunpräzipitation gesammelt wurden, wurden mit Lysaten aus Zellen gemischt, die SHP2 überexprimieren, und die Konzentratione...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nitrozellulose-Membranen	General Electric	10600004
Mikrozentrifuge	Eppendorf	5424-R	1,5 mL
BCA	Fischer	Artikel-Nr.: 23225	Bi-Cinchoninsäure-Assay
Anti-SHP2	Santa Cruz	SC-280
Anti-GFP-Agarose	MBL	Nr. D153-8
Anti-GFP	Roche	118144600
Anti-Aktin	Santa Cruz	SC-1616
HEK-293 Zellen	ATCC	CRL-1573
Orthovanadat	Sigma	Nr. S6508
Proteasehemmer-Cocktail	Roche	11836170001	EDTA-frei
Tris-Glycin SDS Probenpuffer (2x)	Invitrogen	Nr. LC2676	Modifizierter Laemmli-Puffer
4-20% Tris-Glycin Mini-Gele	Invitrogen	XP04205BOX	15 Bohrungen
Trypsin-EDTA (0,25%) Phenolrot	Gibco	25200114
NaCl	Sigma	Nr. S7653	Natriumchlorid