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1. ELISA-Analyse der Wechselwirkung zwischen rekombinanter PH und Vn
HINWEIS: Steuerelemente müssen eingeschlossen werden, um unspezifische Bindungen auszuschließen. Als Positiv- bzw. Negativkontrollen werden humane Faktor H (FH) oder C4b-bindendes Protein (C4BP) verwendet.
- Verdünnen Sie jedes der humanen Proteine (Vn, FH und C4BP) separat auf 50 nM in Tris-HCl, pH 9,0 (Beschichtungspuffer). Geben Sie 100 μl Proteinlösung in jede Vertiefung einer Polysorp-Mikrotiterplatte. Verschließen Sie die Platten mit dem Deckel und lagern Sie sie über Nacht (16 h) bei 4 °C, um die Immobilisierung des Proteins in den Mikrotiterplatten-Vertiefungen zu erleichtern.
- Entsorgen Sie die Lösung aus der Mikrotiterplatte, indem Sie sie kopfüber über das Waschbecken kippen, und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 300 μl PBS/Vertiefung. Blockieren Sie die beschichteten Wells für 1 h bei RT mit PBS mit 2,5 % (w/v) BSA (PBS-BSA).
- Nach dem Entfernen der Blockierungslösung werden die Vertiefungen dreimal mit 300 μl PBS gewaschen, die 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST) pro Vertiefung enthalten. Geben Sie 100 μl 50 μL rekombinantes His-markiertes PH in jede Probenvertiefung und inkubieren Sie es 1 h lang bei RT. In Kontrollvertiefungen sind nur 100 μl PBS-BSA.
Anmerkung: Das lph-Gen, das für PH aus Hif kodiert, wurde mittels PCR amplifiziert und in den pET26b-Expressionsvektor kloniert, der am C-Terminus des exprimierten Proteins ein 6× His-Tag hinzufügt. Der rekombinante Vektor wurde zur Expression in E. coli BL21(DE3) transformiert. Ni-NTA-Harz wurde verwendet, um das rekombinante Protein zu reinigen.
- Verwerfen Sie die Proteinlösung und entfernen Sie die ungebundenen Proteine, indem Sie die Vertiefungen dreimal mit 300 μl PBST pro Vertiefung waschen. Fügen Sie 100 μl PBS-BSA hinzu, das Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertes anti-His pAbs (1:10.000 Verdünnung) enthält, und inkubieren Sie es 1 h lang bei RT.
- 20 mM Lösung A wird durch Auflösen von Tetramethylbenzidin in einer Lösung aus 5 % Aceton und 45 % Methanol hergestellt. Zur Herstellung von Lösung B werden 19,2 g Zitronensäure in 1.000 ml H2O gelöst, der pH-Wert durch Zugabe von KOH auf 4,25 eingestellt, dann 230 μl 30 % H2O2 zugegeben. Lagern Sie beide Lösungen im Dunkeln bei RT. Mischen Sie kurz vor der Verwendung 500 μl Lösung B mit 9,5 ml Lösung A, um das ELISA-Nachweisreagenz vorzubereiten.
- Waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 300 μl PBST pro Vertiefung und weisen Sie Antigen-Antikörper-Komplexe nach, indem Sie 100 μl ELISA-Nachweisreagenz in jede Vertiefung geben.
- Fügen Sie 50 μl 1 M H2SO4/Vertiefung hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Messen Sie die optische Dichte der Wells bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader.