β-Laktamase-basierter konduktimetrischer Biosensor-Assay für Protein-Protein-Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Quelle: Vandevenne, M., et al. Die Verwendung eines konduktimetrischen Biosensor-Assays auf β-Lactamase-Basis zum Nachweis biomolekularer Wechselwirkungen. J. Vis. (2018)

Dieses Video zeigt einen konduktimetrischen Biosensor-Assay, um die Interaktion eines Antikörpers mit einem Zielantigen zu untersuchen, das auf einem Schallkopfchip immobilisiert ist. Der Biosensor ist so konstruiert, dass er ein bifunktionelles chimäres Protein enthält – ein β-Lactamase-Enzym mit einer funktionellen katalytischen Stelle, die mit einem Nanobody fusioniert ist, um an das immobilisierte Zielantigen zu binden. Bei der Bindung erzeugt die katalytische Hydrolyse eines Antibiotika-Substrats durch das β-Lactamase-Enzym ein elektrisches Signal, das die Antigen-Antikörper-Interaktion bestätigt.

Protokoll

1. Vorbereitung von Proteinproben

1. Produzieren und reinigen Sie das Hybridprotein BlaP-cAb-Lys3, wie in unserer vorherigen Studie berichtet. Lagern Sie das Protein in 50 mM Phosphatpuffer pH 7,4 mit folgender Zusammensetzung: 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ und 0,24 g KH₂PO₄, gelöst in 800 mL destilliertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 7,4 ein, bevor Sie das endgültige Volumen der Lösung auf 1 l einstellen.
2. Bereiten Sie eine Hühnerei-Lysozym-Stammlösung (HEWL) vor. 100 mg (40.000 Einheiten/mg) kommerziell erworbenes HEWL werden in 10 ml Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS siehe Schritt 2.1.1) gelöst. Sterilisieren Sie die Proteinlösung durch Filtration mit Filtern mit einem Cutoff von 0,22 μm.

2. Biosensor-Assays

1. Lösungs- und Puffervorbereitung
   1. Bereiten Sie 50 mM PBS vor, indem Sie 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄ und 0,24 g KH₂PO₄ in 800 ml destilliertem Wasser auflösen. Mit 1 N HCl oder 1 N NaOH auf pH 7,4 einstellen, bevor das Volumen der Lösung auf 1 l eingestellt wird. Mit dem Filter sterilisieren und bei 4 °C lagern.
   2. Bereiten Sie eine Sättigungs-/Blockierungslösung her, indem Sie 3 g Kaseinhydrolysat in 100 ml PBS auflösen, das wie oben beschrieben hergestellt wurde (siehe Schritt 2.1.1). Filter, sterilisieren und bei 4 °C lagern.
   3. Bereiten Sie eine Bindungslösung her, indem Sie 1 g Kaseinhydrolysat in 100 ml PBS lösen, das wie oben beschrieben hergestellt wurde (siehe Schritt 2.1.1). Filter, sterilisieren und bei 4 °C lagern.
   4. Bereiten Sie eine Waschlösung (0,1 % Tween - PBS) vor, indem Sie 100 μl Tween 20 (100 %) in 100 ml PBS geben, das wie oben beschrieben hergestellt wurde (siehe Schritt 2.1.1). Bei 4 °C lagern.
   5. Bereiten Sie eine Elektrodenvorbereitungslösung (1% Triton X-100 - PBS) vor, indem Sie 1 mL Triton X-100 (100%) in 100 mL PBS geben, das wie oben beschrieben hergestellt wurde (siehe Schritt 2.1.1). Bei 4 °C lagern.
   6. Bereiten Sie eine Elektroden-Regenerationslösung (3,5 M KCl) vor, indem Sie 26 g KCl in destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 100 ml auflösen. Filter sterilisieren und bei 4 °C lagern.
   7. Bereiten Sie eine 5 mM NaCl-Lösung vor, indem Sie 0,29 g NaCl in destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 l auflösen. Filtrieren, sterilisieren und bei 4 °C lagern. Bereiten Sie dann eine Nachweislösung (4 mM Benzylpenicillin) vor, indem Sie 26,7 mg Benzylpenicillin in 20 ml 5 mM NaCl-Lösung auflösen. Filter, sterilisieren und bei -20 °C lagern.
2. Sensorvorbereitung und -regeneration
   Anmerkung: Die polyanilinbeschichteten Sensorchips wurden von Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus und Prof. Y. Glupczynski (Katholische Universität Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne) entwickelt und freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Die Beschreibung des Sensors sowie die Polyanilin-Elektropolymerisationsprotokolle, die zur Synthese dieser Sensoren verwendet werden, sind in ihren früheren Arbeiten detailliert beschrieben. Kurz gesagt, dieses System verwendet wiederverwendbare Sensoren von acht einzelnen Chips, die mit klassischen Leiterplattentechniken (PCB) hergestellt wurden. Die einzelnen Chips bestehen aus drei runden Elektrodenflecken. Die obere ist die Arbeitselektrode, auf der Polyanilin elektrosynthetisiert wurde. Die mittlere ist die Referenzelektrode und die untere Elektrode bildet die Gegenelektrode. Sowohl die Referenz- als auch die Gegenelektrode werden mit festem Ag/AgCl-Amalgam auf der Kohlenstoffschicht funktionalisiert.
   1. Die Elektroden werden 3 Mal gewaschen, indem die Spitzen in Vertiefungen einer 96-Well-Platte getaucht werden, die 300 μl/Vertiefung Elektrodenvorbereitungslösung (1 % Triton X-100 - PBS, siehe Schritt 2.1.5.) enthält. Führen Sie jede Wäsche 2 Minuten lang unter sanftem Mischen bei Raumtemperatur durch.
   2. Spülen Sie die Elektroden, indem Sie die Spitzen 2 Minuten lang in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 μl/Vertiefung destilliertem Wasser tauchen, wobei Sie sie vorsichtig bei Raumtemperatur mischen.
   3. Die Elektroden werden regeneriert, indem die Spitzen über Nacht bei 4 °C oder 1 h bei Raumtemperatur in Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 300 μl/Vertiefung Regenerationslösung (3,5 M KCl, siehe Schritt 2.1.6) getaucht werden.
   4. Die Elektroden werden 3 Mal gewaschen, indem die Spitzen in Vertiefungen einer 96-Well-Platte getaucht werden, die 300 μl/Vertiefung Phosphatpuffer-Kochsalzlösung enthält (siehe Schritt 2.1.1.). Führen Sie jede Wäsche 2 Minuten lang unter sanftem Mischen bei Raumtemperatur durch.
3. Bindungsassay auf dem Sensor
   1. Beschichten Sie HEWL auf die PANI-Oberfläche (Polyanilin) der Elektrode, indem Sie einen 15-μl-Tropfen von 40 μg/mL HEWL, das in PBS hergestellt wurde, auf die Elektrodenoberfläche aufbringen. Über Nacht bei 4 °C oder 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
   2. Die Elektroden werden dreimal mit Phosphatpuffersalzlösung gewaschen (siehe Schritt 2.1.1), indem die Elektrodenteile der Sensorchips in Vertiefungen einer 96-Well-Platte getaucht werden, die 300 μl/Vertiefung Phosphatpuffersalzlösung enthält. Führen Sie jede Wäsche 2 Minuten lang unter sanftem Mischen bei Raumtemperatur durch.
   3. Tränken Sie die Elektroden, indem Sie einen 50 μl Tropfen der Blockierungslösung (siehe Schritt 2.1.2) auf die Elektrodenoberfläche geben. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Dann dreimal waschen, wie im vorherigen Schritt beschrieben (siehe Schritt 2.3.2).
   4. Die BlaP-cAb-Lys3-Lösung wird auf 20 μg/ml in Bindelösung verdünnt (siehe Schritt 2.1.3) und ein Tropfen dieser verdünnten Lösung von 15 μl auf die Elektroden aufgetragen. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Antigen-Nanokörper-Reaktion waschen Sie sich dreimal, wie im vorherigen Schritt beschrieben, mit der Waschlösung (siehe Schritt 2.1.4). Spülen Sie dann die Elektrode einmal mit PBS (siehe Schritt 2.1.1).
   5. Zur Detektion stecken Sie den Sensorchip über das Kupfer-Schaltungsteil in ein Digitalmultimeter. Initiieren Sie dann die Sensorreaktion, indem Sie einen 50-μl-Tropfen Detektionslösung (siehe Schritt 2.1.7) auf die positiven Elektroden und einen 50-μl-Tropfen NaCl-5-mM-Lösung auf die negativen Elektroden auftragen (siehe Schritt 2.1.7). 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Überwachen Sie den Leitwert mit einem Digitalmultimeter.
      Anmerkung: Das Multimeter wurde von Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus und Prof. Y. Glupczynski's (Katholische Universität Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne) zur Verfügung gestellt. Dieser Potentiostat wird über einen USB-Anschluss computergesteuert und analysiert die acht verschiedenen Chips des Sensors gleichzeitig. Die von Yunus und Kollegen entwickelte Software erstellt ein Echtzeitdiagramm, das die Messungen der Leitwertdifferenz zwischen der Referenz- und der Probenelektrode im Verhältnis zur Zeit darstellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
reagenzien
KH2PO4	Sigma-Aldrich	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128
NaCl	Sigma-Aldrich	Nr. S7653
Tris–HCl	Roche	10812846001
Edta	Sigma-Aldrich	Nr. E9884
Kcl	Sigma-Aldrich	Nr. P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	NIST2186II
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
Alanin	Sigma-Aldrich	Nr. A7627
HClO4	Fluka	Artikel-Nr.: 34288	1M HClO4-Lösung, Verteiler : Sigma-Aldrich
Kaseinhydrolysat	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 22090
Benzylpenicillin-Natrium	Sigma-Aldrich	B0900000
Henne Eiweiß Lysozym	Roche	10837059001
Heptan	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	Sigma-Aldrich	322415
Ammoniumhydroxid-Lösung	Sigma-Aldrich	380539	28% NH3 in H2O, gereinigt durch Doppeldestillation (konzentriert?)
Verbrauchsmaterialien für Labore
6-Well-Platte	Greiner Bio-One	657165	CELLSTAR 6-Well-Platte
Ausrüstung
pH-Messgerät	WTW	1AA110	pH-Messgerät für Labors inoLab pH 7110
Vakuum- und Filtersystem	Nalgene	NALG300-4100	Filterhalter mit Abscheider, Verteiler : VWR
Potentiometrische Sensorchips			hergestellt von Yunus und Kollegen (ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		abgekündigt, Nachfolger Autolab PGSTAT302N
Digital-Multimeter, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		abgekündigt, Nachfolger Metrahit Base