1. Zellen
- Zwei Tage vor Beginn des Eingriffs werden die Zellen mit der erforderlichen Dichte plattiert, um am Tag des Experiments konfluent zu sein. Plattieren Sie die Zellen in Kolben oder Platten. Die Proteinextraktion aus Platten wird jedoch einfacher sein. Es ist zweckmäßig, mindestens 4 Platten à 78 cm2 oder 2 Fläschchen à 150 cm2 pro Bedingung und Versuch vorzubereiten, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse konsistent sind.
- In dieser Studie wurden humane G166-GSCs in 4 Flaschen zu 150 cm2 kultiviert, kultiviert in RHB-A-Stammzellmedium, das mit 2 % B27, 1 % N2, 20 ng/ml EGF und b-FGF ergänzt wurde, wie von Pollard et al. beschrieben. Prozess, wenn die Konfluenz erreicht wurde. Wenn beispielsweise 5 x 106 G166-Zellen in einem 150 cm2-Kolben plattiert wurden, wurden sie 2 Tage nach der Beschichtung verarbeitet.
2. Biotinylierte CPPs
- Die Fläschchen mit den lyophilisierten biotinylierten CPPs (BCPPs) werden 30 s lang bei 8200 x g gedreht, um zu vermeiden, dass ein Teil des Pulvers auf dem Deckel verbleibt. Fügen Sie ein Steuerelement-BCPP ein, um sicherzustellen, dass die gefundenen Wechselwirkungen spezifisch für die Zielsequenz sind. In dieser Studie war das Kontroll-BCPP TATbiotin (TAT-B) und das Behandlungs-BCPP TAT-Cx43266-283-B. Es könnten auch andere Kontrollen verwendet werden, wie z. B. TAT, die mit verschlüsselten oder mutierten Fragmenten fusioniert sind, die an Biotin gebunden sind.
- Löse die BCPP in dem entsprechenden Kulturmedium in der vom Hersteller angegebenen Stammlösung auf. Um beispielsweise eine Stammlösung von 2 mg/ml BCPP zur Behandlung von GSC zu erhalten, gib 0,5 ml GSC-Kulturmedium in eine Durchstechflasche mit 1 mg BCPP. Vortex und stelle sicher, dass das Peptid gut aufgelöst ist.
3. Rohre
HINWEIS: Bereiten Sie mindestens zwölf 1,5-ml-Röhrchen pro Bedingung vor, die in der Sektion erforderlich ist
- Markieren Sie die ersten 3 Tuben pro Zustand. Sie haben das Gesamtvolumen der zellulären Lysate, das in Schritt 6.4 erhalten wurde.
- Markieren Sie ein A in 3 Tuben pro Zustand. Diese Röhren werden die ersten Überstände aufweisen, die nach dem Lysieren und Spinnen der zellulären Lysate (Schritt 7.2) erhalten wurden.
- Markieren Sie ein B in 3 Tuben pro Zustand. Diese Röhren haben ein kleines Aliquot der ersten Überstände. Diese Lysate dienen als Western-Blot-Proben in Schritt 7.3.
- Markieren Sie ein C in 3 Röhrchen pro Zustand. Diese Röhrchen erhalten die Überstände, die nach dem Pull-down mit NeutrAvidin, Schritt 7.7.
Anmerkung: Dies ist wichtig für den Fall, dass der Western Blot kein Signal für Proteine zeigte, was bedeutet, dass die Proteine nicht abgebaut wurden oder in einem Schritt des Verfahrens verloren gingen. Wenn dies der Fall wäre, wiederholen Sie den Vorgang, um die Proteine herunterzuziehen.
4. Zelluläre Behandlung mit den BCPPs
- Aspirieren Sie das Nährmedium.
- Das entsprechende Volumen an frischem Medium, das für die Inkubation der BCPP erforderlich ist, wird entsprechend den Inkubationszeiten durch das kleinstmögliche Volumen des Mediums ersetzt. Es ist sehr wichtig, dass das Medium in jedem Fall die gesamte Oberfläche der Platte/des Kolbens vollständig bedeckt, damit die Zellen nicht austrocknen, z. B. 6 ml pro 150 cm2 für eine 30-minütige Inkubation.
- Geben Sie das Volumen der Stammlösung von BCPP zu den Zellkulturen, um die Konzentration zu erreichen, die sich als wirksam erwiesen hat. In dieser Studie wurde nachgewiesen, dass 50 μM TAT-Cx43266-283-B die GSC-Proliferation reduziert.
- Fügen Sie daher 92,8 μl 2 mg/ml TAT-Cx43266-283-B (MW=3723,34 g/mol) pro ml Kulturmedium hinzu, um eine Endkonzentration von 50 μM TAT-Cx43266-283-B zu erhalten. Wenn das hinzuzufügende Volumen für Kontrollpeptide unterschiedlich ist, mit Kulturmedium bis zum gleichen Endvolumen ergänzen. Zum Beispiel wurden 49,1 μL TAT-B (MW=1914,31 g/mol) plus 43,7 μl GSC-Medium pro mL Kulturmedium zugegeben, um eine Endkonzentration von 50 μM TAT-B zu erhalten.
- Legen Sie die Zellen 30 Minuten lang bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator, um sicherzustellen, dass die Wechselwirkungen zwischen dem BCPP und seinen intrazellulären Partnern stattfinden. Wenn die Interaktion länger dauert, inkubieren Sie länger oder passen Sie die Zeiten an, falls das Experiment aus einem Zeitverlauf bestand. Darüber hinaus kann die Interaktion von Interesse durch die Stimulation verschiedener intrazellulärer Signalwege gefördert oder verhindert werden.
5. Puffer und Lösungen
- Bereiten Sie PBS pH 7,4 vor: 136 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4,2H 2O; 1,7 mM KH2PO4.
- Bereiten Sie den Proteinlysepuffer vor: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 137 mM NaCl, 1% IGEPAL, Vor der Verwendung Folgendes hinzufügen: 1/100 (v/v) Proteaseinhibitor-Cocktail, 1 mM Natriumfluorid, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und 0,1 mM Natriumorthovanadat.
- Laemmli-Puffer vorbereiten: (4x: 0,18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M Glycerin; 3,7 % SDS (p/v); 0,6 M β-Mercaptoethanol oder 9 mM DTT; 0,04 % (v/v) Bromphenolblau (BB)).
6. Protein-Extraktion
HINWEIS: Die Proteinextraktion wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Führen Sie diesen gesamten Abschnitt des Eingriffs bei 4 °C durch.
- Aspirieren Sie das Nährmedium vollständig.
- Waschen Sie 3 x 10 mL mit eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pro 150 cm2 sehr vorsichtig, um eine Zellablösung zu vermeiden.
- Um das Zelllysat zu erhalten, fügen Sie 3 ml Lysepuffer pro 150 cm2 hinzu und kratzen Sie die Oberfläche mit einem Zellschaber gründlich ab. Wenn Sie die Platte/den Kolben um etwa 45 Grad neigen, lassen sich die Zelllysate leichter in die entsprechenden Röhrchen sammeln.
- Gießen Sie 1 ml des zellulären Lysats pro Röhrchen in drei 1,5 ml-Röhrchen. Diese Röhrchen werden mit dem Zustand und der Replik gekennzeichnet, wie in Schritt 3.1 angegeben.
7. Pulldown
- Zentrifugieren Sie die 1,5 mL Röhrchen bei 11.000 x g für 10 min bei 4 °C.
- Die Überstände in neue Röhrchen (A) umfüllen.
- Nehmen Sie ein Aliquot dieses Überstands pro Bedingung auf verschiedene Röhrchen (B), d.h. 50 μL pro Röhrchen. 4x Laemmli Puffer (16,6 μl für 50 μl Lysat) zugeben und bei -20 °C einfrieren. Diese Lysate dienen als übliche Western-Blot-Proben.
- Homogenisieren Sie das NeutrAvidin Agarose durch leichtes Schütteln sehr gut. Schneiden Sie die Spitzen der Pipettenspitzen ab, um ihren Durchmesser zu vergrößern und das Pipettieren der Kügelchen zu verbessern. 50 μl NeutrAvidin-Agarose pro ml Zelllysat in die (A)-Röhrchen geben.
- Inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C unter sehr leichtem Schütteln, damit NeutrAvidin mit BCPPs, die an ihre intrazellulären Partner gebunden sind, interagieren kann.
- Zentrifugieren Sie bei 3.000 x g für 1 min bei 4 °C, um den Komplex von NeutrAvidin mit Proteinen zu sammeln.
- Die Überstände vorsichtig entfernen und in saubere Röhrchen (C) umfüllen. Bewahren Sie sie auf, um sie für den Fall zu verwenden, dass der Pulldown nicht erfolgreich ist.
- Waschschritte: Frischen Lysepuffer auf die Pellets (Röhrchen A) geben, durch Inversion resuspendieren und die Schritte 7.6 und 7.7 noch fünfmal wiederholen. Alle diese Überstände können verworfen werden.
- Entfernen Sie die Überstände und fügen Sie 2x Laemmli-Puffer auf das gewünschte Endvolumen hinzu (40 μl pro 1,5-ml-Röhrchen für Pellets, die aus 2 cm Kolben konfluenter Zellen gewonnen werden).
- Eluieren Sie 5 min lang bei 100 °C, um die Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu dissoziieren, und zentrifugieren Sie 30 s lang bei 8.200 x g, um NeutrAvidin-Kügelchen zu pelletieren.
- Die Überstände, die die dissoziierten Proteine enthalten, werden mit den Kapillarspitzen in neue Röhrchen gegeben (D). Die Kügelchen können aufbewahrt werden, falls wiederholte Elutionsschritte erforderlich sind.
Anmerkung: Die Überstände (Röhrchen D) sind nun bereit, in Western Blot geladen oder bei -20 °C eingefroren zu werden.
