Hefe-Zwei-Hybrid-Assay zur Bestimmung der Protein-Selbstassoziation in Hefezellen

Zusammenfassung

Quelle: Stanczyk, P. J., et al., Genetische und biochemische Ansätze für die In-vivo- und In-vitro-Bewertung der Proteinoligomerisierung: Die Ryanodinrezeptor-Fallstudie. J. Vis. (2016)

Dieses Video zeigt den Hefe-Zwei-Hybrid-Assay zum Nachweis spezifischer Protein-Selbstinteraktionen. In diesem Assay wird das Protein von Interesse an zwei Domänen eines Transkriptionsfaktors gebunden, der für das β-Galactosidase-Enzym kodiert. Wenn die beiden Proteine interagieren, bewirkt dies, dass Transkription und Translation das Enzym bilden, das dann mit einem biochemischen Assay nachgewiesen wird.

Protokoll

1. Hefe-Umwandlung

1. Hefe durch Zentrifugation (in 50-ml-Röhrchen) bei 1.500 x g für 5 min bei RT ernten. Den Überstand entsorgen, jedes Pellet in 5 ml sterilem H₂O resuspendieren und zusammen poolen.
2. Bei 1.500 x g für 5 min bei RT erneut zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Hefepellet in 1 ml frisch zubereitetem, sterilem 1x LiAc/TE.
   resuspendieren Anmerkung: Verwenden Sie kompetente Hefezellen innerhalb von 1 Stunde nach der Zubereitung.
3. Bereiten Sie Plasmidproben (in 1,5-ml-Röhrchen) vor, indem Sie 200 ng Plasmid-DNA für Einzeltransformationen oder 0,5 - 1 μg jeder Plasmid-DNA für Co-Transformationen und 100 μg Heringshoden-Träger-DNA (20 Minuten gekocht und kurz vor der Verwendung auf Eis abgekühlt) hinzufügen.
   HINWEIS: Fügen Sie eine Positivkontrolle hinzu, z. B. Hefe, die mit pVA3 co-transformiert ist (kodiert für die GAL4-DNA-BD-Fusion mit dem p53-Protein) und pTD1 (kodiert für die GAL4 AD-Fusion mit dem großen SV40-T-Antigen).
4. 100 μl der frisch zubereiteten, kompetenten Hefesuspension und 600 μl 1x LiAc/PEG-Lösung (8 ml PEG 3350 aus der Brühe, 1 ml aus der Basis TE, 1 ml LiAc aus der Brühe) zugeben und ~30 Sekunden lang vortexen. 30 min bei 30 °C inkubieren und bei 200 U/min schütteln.
5. 80 μl Dimethylsulfoxid (10 % v/v Endkonzentration) zugeben und durch sanfte Inversion gut mischen. Hitzeschock für 15 min in einem 42 °C warmen Wasserbad unter Rühren alle 2 - 3 min.
6. Die Zellsuspension 2 min lang auf Eis kühlen und 15 sec bei RT bei 14.000 x g zentrifugieren, um die Hefe zurückzugewinnen.
7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl 1x TE und laben Sie es auf geeigneten Platten mit minimalem SD-Medium für selektives Wachstum (Medium ohne Leucin und Tryptophan, um den selektiven Druck sowohl auf die Köder- als auch auf die Zielplasmide aufrechtzuerhalten).
8. Inkubieren Sie die Platten kopfüber bei 30 °C, bis die Bienenvölker einen Durchmesser von ~2 mm haben (normalerweise 4 - 5 Tage). Die Platten können 2 - 3 Wochen bei 4 °C gelagert werden; Für eine längere Lagerung Glycerin einlagern und bei -80 °C lagern.
   Anmerkung: Es ist sicherzustellen, dass Köder- und Zielproteine in Hefe durch Immunblotting exprimiert werden und dass sie keine Aktivierung des autonomen Reportergens aufweisen, wenn sie separat in Hefe exprimiert werden.
9. 100 μl der frisch zubereiteten, kompetenten Hefesuspension und 600 μl 1x LiAc/PEG-Lösung (8 ml PEG 3350 aus der Brühe, 1 ml aus der Basis TE, 1 ml LiAc aus der Brühe) zugeben und ~30 Sekunden lang vortexen. 30 min bei 30 °C inkubieren und bei 200 U/min schütteln.
10. 80 μl Dimethylsulfoxid (10 % v/v Endkonzentration) zugeben und durch sanfte Inversion gut mischen. Hitzeschock für 15 min in einem 42 °C warmen Wasserbad unter Rühren alle 2 - 3 min.
11. Die Zellsuspension 2 min lang auf Eis kühlen und 15 sec bei RT bei 14.000 x g zentrifugieren, um die Hefe zurückzugewinnen.
12. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl 1x TE und laben Sie es auf geeigneten Platten mit minimalem SD-Medium für selektives Wachstum (Medium ohne Leucin und Tryptophan, um den selektiven Druck sowohl auf die Köder- als auch auf die Zielplasmide aufrechtzuerhalten).
13. Inkubieren Sie die Platten kopfüber bei 30 °C, bis die Bienenvölker einen Durchmesser von ~2 mm haben (normalerweise 4 - 5 Tage). Die Platten können 2 - 3 Wochen bei 4 °C gelagert werden; Für eine längere Lagerung Glycerin einlagern und bei -80 °C lagern.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Köder- und Zielproteine in Hefe durch Immunblotting exprimiert werden und dass sie keine autonome Reportergenaktivierung aufweisen, wenn sie separat in Hefe exprimiert werden.

2. Colony-Lift-Filterpapier β-Gal-Assay

1. Bereiten Sie die folgenden Puffer vor:
   1. Bereiten Sie einen Z-Puffer vor, der 100 mM Na₂HPO₄, 40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KCl und 1 mM MgSO₄ enthält; stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. Durch Autoklavieren sterilisieren und bei RT lagern.
   2. Bereiten Sie den X-Gal-Puffer vor, indem Sie 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid bei 20 mg/ml in N,N-Dimethylformamid auflösen und im Dunkeln bei -20 °C lagern. Bereiten Sie Z-Puffer/X-Gal-Lösung vor. Stellen Sie vor der Verwendung Puffer her, indem Sie X-Gal mit 0,33 mg/ml und β-Mercaptoethanol mit 0,27 % v/v im Z-Puffer mischen. Verwenden Sie 2,5 ml pro Probe.
2. Geben Sie 2,5 ml frisch zubereiteten Z-Puffer/X-Gal-Lösung in eine saubere 100-mm-Platte und legen Sie sie in ein Zellulosefilterpapier.
3. Legen Sie ein neues Filterpapier auf die Oberfläche der Platte mit den zu untersuchenden Hefekolonien. Reiben Sie das Filterpapier vorsichtig mit einer Pinzette auf die Platte und lassen Sie es ~5 Minuten einwirken, damit sich die Kolonien festsetzen können.
   Anmerkung: Die Positivkontrolle wird parallel durchgeführt, d.h. die Hefe wird mit pVA3 und pTD1 cotransformiert.
4. Heben Sie das Filterpapier an und tauchen Sie es (mit einer Pinzette) für 30 Sekunden in ein Becken mit flüssigem Stickstoff (flüssiger Stickstoff sollte mit Vorsicht behandelt werden; tragen Sie immer dicke Handschuhe und eine Schutzbrille). Lassen Sie das gefrorene Filterpapier ~2 min bei RT auftauen.
5. Legen Sie das Filterpapier mit der Kolonieseite nach oben auf das vorgetränkte Filterpapier in der 100-mm-Platte und inkubieren Sie es bei 30 °C.
6. Überprüfen Sie regelmäßig (alle ~30 Minuten) das Auftreten von blauen Kolonien.
   Anmerkung: Schwacher Köder: Es kann mehrere Stunden dauern, bis die Zielinteraktionen ein positives blaues Signal erzeugen (vermeiden Sie eine längere Inkubation (>8 Stunden), die zu falsch positiven Ergebnissen führen kann). Für beste Ergebnisse verwenden Sie frisch co-transformierte Kolonien, d.h. die 4 - 5 Tage lang bei 30 °C mit einem Durchmesser von ~2 mm gezüchtet wurden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Platten-Inkubator	Hereaus	Nr. B6120	Gerät
Inkubator für Orbitalschüttler	New Brunswick Scientific	INNOVA 4300	Gerät
Spektralphotometer	Perkin Elmer	Lambda Bio+	Gerät
Matchmaker Zwei-Hybrid-System 2 Bausatz	Takara Clontech	Nr. K1604-1	Enthält den Ködervektor pGBKT7, den Beutevektor pACT2 und den Hefestamm Y190
Hefe-Stickstoff-Basis	Sigma-Aldrich	Nr. Y0626	Zur Herstellung von minimalem SD-Growh-Medium
Dropout-Supplement ohne Leucin und Tryptophan	Sigma-Aldrich	Nr. Y0750	Zur Herstellung von minimalem SD-Growh-Medium
Dropout-Ergänzung ohne Leucin, Tryptophan, Histidin	Sigma-Aldrich	Jahr2001	Zur Herstellung von minimalem SD-Growh-Medium
Träger-DNA von Heringshoden	Takara Clontech	Artikel-Nr.: 630440	Für die Hefeumwandlung
Whatman Filterpapier Klasse 5	Sigma-Aldrich	WHA1005070	Zur Verwendung in Colony-Lift-Filterpapier β-Gal-Assays
X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid)	Sigma-Aldrich	Nr. B4252	Zur Verwendung in Colony-Lift-Filterpapier β-Gal-Assays