Tandem-Affinitätsreinigungsassay zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Quelle: Ma, Z., et al. Tandem-Affinitätsreinigung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video demonstriert die Tandem-Affinitätsreinigung — eine Technik zur Reinigung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen, um die Protein-Protein-Interaktion zu untersuchen. Der Komplex enthält zwei Proteine, die mit unterschiedlichen Epitop-Tags markiert sind. Nach der Reinigung des Komplexes unter Verwendung von zwei Harzen mit einer Affinität für die beiden verschiedenen Tags in einer sequentiellen Weise bestätigt das Vorhandensein beider Proteine in der Eluierung die Wechselwirkung zwischen den beiden.

Protokoll

1. Zellen plattieren

1. Einen Tag vor der Transfektion 3,5 x 10⁶ HEK293T Zellen in 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml Stamm) pro 100 mm Schale auffüllen. Platte 3 - 5 100 mm,² Schalen pro Versuch/Bedingung, um eine ausreichende Proteinrückgewinnung zu gewährleisten.
   Anmerkung: Die Anzahl der Platten muss für jedes Experiment/jede Bedingung bestimmt werden, die von den Expressionsniveaus und der Löslichkeit des interessierenden Proteinkomplexes abhängt. Wenn eine Aufreinigung in größerem Maßstab erforderlich ist, können Zelllinien so angepasst werden, dass sie in Suspensionen in Spinnerkolben wachsen, aber diese Methode funktioniert nicht für transiente Transfektionen.

2. Zellen transfizieren oder stabile Zelllinien induzieren

1. Am nächsten Tag kontrollieren Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Die Zellen müssen zu 70 - 80 % konfluent sein, bevor Sie fortfahren können.
2. Transfizieren Sie die Zellen mit einer Gesamtmischung aus 7 μg Plasmid-DNA und 21 μl Transfektionsreagenz pro 100-mm-Schale. Transfizierte Zellen mit einem Vektor, der GFP exprimiert (Tabelle 1), als Kontrolle für die Transfektionseffizienz.
   Anmerkung: Bei Verwendung eines HEK293-T-REx oder einer ähnlichen stabilen Zelllinie, die die Expression von zwei oder mehr komplexen Untereinheiten als Reaktion auf Doxycyclin induziert, muss der Induktor zu den Zellen hinzugefügt und für 48 Stunden inkubiert werden. In ähnlicher Weise wäre eine stabile Zelllinie, die die Expression von GFP bei Zugabe des Induktors induziert, auch für Validierungszwecke erforderlich. Fahren Sie mit Schritt 2.7 fort.
3. Bereiten Sie die Transfektionsmischung pro 100 mm Schale vor. Mischen Sie in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 500 μl unsupplementiertes DMEM mit 7 μg Gesamtplasmid-DNA (entsprechend zwei oder mehr Plasmiden). Mischen Sie in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen 500 μl nicht supplementiertes DMEM mit 21 μl des Transfektionsreagenzes. Wiederholen Sie dies für jede Transfektionsreaktion.
4. Pipettieren Sie die Transfektionsreagenzlösung in die Plasmid-DNA-Lösung (Lösungen nicht in umgekehrter Reihenfolge mischen). Mischen Sie, indem Sie mindestens 4 Mal pipettieren.
5. Inkubieren Sie diese Mischung bei Raumtemperatur für 10 - 15 min, jedoch nicht länger als 15 min.
6. Kippen Sie die Platte, um ein Medienreservoir zu schaffen, und pipettieren Sie das Transfektionsgemisch vorsichtig tropfenweise auf die Innenseite der Platte, ohne die Zellen zu stören. Bringen Sie die Form wieder in ihre ursprüngliche flache Position und schwenken Sie sie vorsichtig, um die Mischung zu verteilen.
7. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator mit 5 % CO₂ (dieser Zustand wird im Folgenden als "Gewebekultur-Inkubator" bezeichnet). Tauschen Sie das Medium 5 Stunden nach der Transfektion aus (optional).

3. Überprüfung der Transfektions- oder Induktionseffizienz

1. 24 Stunden nach der Transfektion visualisieren Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die Transfektionseffizienz zu überprüfen (oder die Induktion der Kontrolle HEK293T-REx-stabilen Zelllinie, die GFP exprimiert). Weitere 24 Stunden inkubieren.

4. STREP-Affinitätsreinigung (STREP AP)

1. Sammeln der Zellen
   1. 48 Stunden nach der Transfektion entfernen Sie das Medium und fügen Sie 8 ml kalte 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu. Pipettieren Sie auf und ab, um Zellen von der Platte zu lösen.
   2. Sammeln Sie die Zellsuspension, geben Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen und schleudern Sie die Zellen 4 Minuten lang bei 4 °C bei 800 x g herunter.
   3. Entfernen Sie den PBS-Überstand. Wiederholen Sie das Schleudern (800 x g für 1 Minute bei 4 °C), um alle PBS-Reste zu entfernen. Lagern Sie das Zellpellet für die zukünftige Verwendung bei -80 °C oder befolgen Sie das untenstehende Verfahren, um die Proteinreinigung fortzusetzen.
2. Lyse der Zellen
   1. Resuspendieren Sie die Zellpellets mit 5× des Zellpelletvolumens (~250 μl pro Platte) passivem Lysepuffer (PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, Proteaseinhibitor-Cocktailtablette, 5 % v/v Glycerin und 1,0 % NP-40) und überführen Sie die Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. Die Suspension kurz einwirbeln und 30 min bei 4 °C nutatisieren.
   3. Die Zellsuspension bei 10.000 x g für 10 min bei 4 °C herunterschleudern.
   4. Übertragen Sie die löslichen Lysate in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Zellpellets. Bewahren Sie 10 % des Endvolumens des löslichen Lysats als "STREP AP Input" auf. Bei 4 °C lagern.
3. Äquilibrierung der STREP-Kügelchen
   Anmerkung: Verwenden Sie STREP-Kügelchen für den ersten AP-Schritt! Komplexe, die mit STREP-Kügelchen abgezogen werden, gewinnen deutlich mehr Protein zurück als solche, die mit FLAG-Kügelchen abgezogen werden.
   1. (n × 40 μl) + n μl der 50%igen STREP-Bead-Aufschlämmung (n = Anzahl der Proben) herausnehmen und bei 1.500 x g für 2 min bei 4 °C herunterschleudern.
      HINWEIS: Verwenden Sie zum Pipettieren von Perlen Weithalsspitzen.
   2. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 500 μl PLB zu den Kügelchen. Die Perlenmischung 5 min bei 4 °C nutieren. Bei 1.500 x g 2 min bei 4 °C eindrehen.
      1. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 Wäschen. Resuspendieren Sie die Kügelchen in PLB auf ein Endvolumen von n × 40 μl.
   Jede
   3. Zelllysatprobe mit 40 μl 50 % STREP-Kügelchenaufschlämmung aufgießen und 2 Stunden lang bei 4 °C nutatieren.
4. STREP AP
   1. Schleudern Sie die Lösung bei 1.500 x g für 2 min bei 4 °C herunter.
   2. Den Überstand entfernen und als "STREP AP Flow-through (FT)" bei 4 °C lagern.
   3. Geben Sie 500 μl STREP AP Waschpuffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 5 % Glycerin und 0,2 % NP-40) zu den Kügelchen. Die Perlenmischung 5 min bei 4 °C nutatieren und bei 1.500 x g 2 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand entsorgen.
      1. Wiederholen Sie dies für insgesamt 4 Wäschen.
         Anmerkung: Übertragen Sie die Kügelchenlösung vor dem vierten Waschen in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, um den Proteinhintergrund zu reduzieren. Dieser Schritt ist unerlässlich.
   4. Fügen Sie 500 μl Waschpuffer II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl und 1 mM EDTA) hinzu und äquilibrieren Sie die Kügelchen, indem Sie die Röhrchen umdrehen. Bei 1.500 x g für 2 min bei 4 °C herunterschleudern und den Überstand wegwerfen.
   5. Eluieren Sie das Protein von Interesse mit 50 μl STREP-Elutionspuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA und 2,5 mM Desthiobiotin). Vortexen bei 800 U/min für 15 min bei 4 °C.
   6. Die Kügelchen bei 1.500 x g 1 min bei 4 °C eindrehen. Den Überstand auffangen. Dieser Anteil entspricht der Probe "STREP AP Elution".
   7. Bewahren Sie die Beadsfraktion bei 4 °C für eine zweite Elution auf, die bis zur Hälfte der mit der ersten Elution erhaltenen Proteinmenge liefern kann. Aliquotieren Sie 10 % der STREP AP-Elution für Silberfärbungen und/oder Western Blotting.
5. Äquilibrieren der FLAG-Kügelchen
   1. Nehmen Sie (n x 16 μl) + n μl FLAG-Beads-Lösung (n = Anzahl der Proben) heraus und schleudern Sie sie bei 1.500 x g für 2 min bei 4 °C herunter.
      Anmerkung: Verwenden Sie zum Pipettieren von Kügelchen mit breiter Öffnung.
   2. Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 500 μl FLAG-Waschpuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,1 % NP-40) zu den Kügelchen. Bei 1.500 x g für 2 min bei 4 °C schleudern. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt 3 Wäschen.
   3. Resuspendieren Sie die Kügelchen in FLAG Waschpuffer auf ein Endvolumen von n x 16 μl.
   4. 16 μl der FLAG-Bead-Slurry zur restlichen STREP AP-Elution geben und über Nacht bei 4 °C nutatieren.

5. FLAGGEN-IP

1. Schleudern Sie die FLAG beads suspension bei 1.500 x g für 2 min bei 4 °C herunter. Bewahren Sie den Überstand auf und lagern Sie ihn als "FLAG IP Flow-through" (FT) bei 4 °C.
2. Geben Sie 500 μl FLAG-Waschpuffer in die Lösung. 5 min bei 4 °C nutatisieren und bei 1.500 x g 2 min bei 4 °C zentrifugieren. Wiederholen Sie dies für insgesamt 4 Wäschen und entfernen Sie den Überstand nach jeder Wäsche.
   Anmerkung: Übertragen Sie die Proteinkügelchenlösung vor dem vierten Waschen in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, um den Hintergrund zu reduzieren. Dieser Schritt ist unerlässlich.
3. Entfernen Sie den Überstand aus der letzten Schleuderung und geben Sie 30 μl FLAG-Waschpuffer mit 200 ng/μl FLAG-Peptid in die Kügelchen. Vortexen bei 800 U/min für 2 Stunden bei 4 °C.
4. Die Suspension bei 1.500 x g für 2 min bei 4 °C herunterschleudern. Den Überstand ernten und bei 4 °C als "FLAG IP Elution" lagern.
   Anmerkung: Die Elutionsproben können durch Silberfärbung und/oder Western Blot unter Verwendung von Standardprotokollen bestätigt werden und sind bereit für weitere Proteinassays. Wenn Sie einen Western Blot einrichten, führen Sie alle folgenden Beispiele aus: (1) STREP AP Input, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elution, (4) FLAG IP FT und (5) FLAG IP Elution. Die geladenen Volumina müssen für jedes Experiment bestimmt werden. Alle gesammelten Proben und Kügelchen können bei 4 °C für die Kurzzeitlagerung und bei -80 °C für die Langzeitlagerung gelagert werden. TAP-Proben könnten mittels Massenspektrometrie analysiert werden, um die Identität ihrer Bestandteile zu verifizieren, neuartige posttranslationale Modifikationen (PTMs) zu identifizieren und/oder eine neue Proteininteraktion mit dem gereinigten Komplex zu entdecken. Zu diesem Zweck können nach dem Auftragen eines Coomassie-Gels oder Silberflecks mit einem sauberen Skalpell Bänder aus dem Gel herausgeschnitten werden. Es wurden bereits mehrere hervorragende Übersichtsarbeiten veröffentlicht, die sich mit Methoden der Massenspektrometrie befassen.

Ergebnisse

Tabelle 1: In dieser Studie verwendete Plasmide. CycT1 und CDK9 wurden in die Plasmidvektoren pcDNA/4TO-STREP und pcDNA/4TO-FLAG ligiert. Diese Konstrukte wurden in DH5α-kompetente Zellen umgewandelt und auf LB-Ampicillin-Platten plattiert. Die Kolonien wurden ausgewählt, gezüchtet und gescreent. Erfolgreich ligierte Klone wurden durch Sanger-Sequenzierung und die Kombination von Restriktionsverdau und Agarosegelelektrophorese verifiziert. Für CycT1 haben wir eine kürzere Version (1 - 708) anstelle der voll...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbeccos modifizierter Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	SH30022FS
Fötales Rinderserum	Hyklon	SH30071
Penicillin/Streptomycin	Fisher Scientific	MP091670049
PolyJet	Fisher Scientific	Tel.: 50-478-8
Proteasehemmer-Cocktail	Roche	11836153001
STREP-Taktin-Superflow	Iba	Artikel-Nr.: 2-1208-010
STREP-Tag-Elutionspuffer	Iba	Tel.: 2-1000-025
EZview Rot ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	SLBQ1981V
Corning 100 mm × 20 mm Stil Dish Cell Culture behandeltes pyrogenes Polystyrol 20/Hülse	Corning	430167
Protein Lo-Bind Eppendorf	Fisher Scientific	Tel.: 13-698-794
Digitaler Vortex-Mischer	Fisher Scientific	Tel.: 02-215-370
48-Loch Mikrorohr-Schaumstoffgestell	Fisher Scientific	Tel.: 02-215-386
Labquake Schüttler Drehspieß	Thermo	Artikel-Nr.: 415110