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Für die vorliegende Studie wurde ein CVN-small ubiquitin-like modifier (SUMO) Fusionsprotein in enzymgebundenen Immunsorbent-Assays anstelle von CV-N verwendet und ist für zellbasierte Assays geeignet. Das rekombinante Influenza-A-Virus HA H3-Protein in voller Länge wird kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle) oder in Säugetier-HEK293-Zelllinien und Baculovirus-infizierten Insektenzellen gemäß Standardprotokollen exprimiert. Das Wuhan-1-Spike-Protein wird in HEK293-Zellen von Säugetieren exprimiert. Die Synthese von mon-mannosyliertem Peptid (MM) und di-mannosyliertem Peptid (DM) ermöglicht den Nachweis homogener Liganden zu CVN2 und mono-mannosylierten kleinen Molekülen.
1. Erstellen von CV-N-Konstrukten
- Für jede der CVN2-Varianten und des CVN2L0-Proteins (PDB-ID 3S3Y) erhalten Sie das Genkonstrukt mit einer N-terminalen pelB-Leader-Sequenz und einem His-Tag in pET27b(+)-Vektor aus kommerziellen Quellen (siehe Tabelle 1).
- Abrufen von CVN2L0 und seinen Varianten (V2, V3, V4 und V5; Abbildung 1A,C) im Hintergrund eines CVN2L0-Template-Gens, das aus zwei unterschiedlichen DNA-Sequenzen für jeden CV-N-Repeat besteht.
- Die lyophilisierte Plasmid-DNA wird in sterilem deionisiertem destilliertem Wasser (ddH2O) auf eine Endkonzentration von 100 ng/μl gelöst.
2. Herstellung von LB-Agarplatten mit Plasmid-DNA-transformierten Zellen
- Bereiten Sie das Kulturmedium LB-Lennox vor, indem Sie 10 g/l Pepton, 5 g/l Hefeextrakt und 5 g/l NaCl in ddH2O auflösen (siehe Materialtabelle) und den pH-Wert auf 7,4 einstellen. Die Umwandlung in kompetente E. coli BL21 (DE3) für jede Variante (V2-V5) wird nach chemischer Methode nach einem zuvor veröffentlichten Bericht durchgeführt.
- Teilen Sie die Lösung (900 μl und 100 μl), übertragen Sie 100 μl auf LB-Agar-Platten (50 μg/ml Kanamycin) und verwenden Sie vorsichtig einen sterilen Zellspreizer. Inkubieren Sie die Agarplatten über Nacht bei 37 °C.
3. Klonen
- Subklonieren Sie das Gen für CV-N in die NdeI- und BamHI-Stellen von pET11a (siehe Materialtabelle) zur Umwandlung (Elektroporation) in elektrokompetente Zellen nach der Referenz.
4. Ortsgerichtete Mutagenese
- Zur Erzeugung von CVN2L0 und der Mutante CVN-E41A im Hintergrund eines CVN2L0-Template-Gens, das zwei unterschiedliche DNA-Sequenzen für jede CV-N-Wiederholung enthält.
- Nehmen Sie Mutationen unter Verwendung eines ortsgerichteten Mutagenese-Kits (siehe Materialtabelle) und spezifischer mutagener Primer 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' und 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' für die Durchführung der PCR vor.
- Starten Sie eine Reihe von Probenreaktionen mit mehreren Konzentrationen von doppelsträngiger DNA (dsDNA)-Template im Bereich von 5 bis 50 ng (z. B. 5, 10, 20 und 50 ng dsDNA-Template). Halten Sie die Primerkonzentration konstant.
Anmerkung: Der PCR-Mix und das Thermocycling-Protokoll werden im Allgemeinen verwendet, wie in der Bedienungsanleitung für das ortsgerichtete Mutagenese-Kit beschrieben.
- Fügen Sie das DpnI-Restriktionsenzym (1 μL, 10 U/μL, siehe Materialtabelle) unterhalb der Mineralölauflage hinzu. Die Reaktionen werden gründlich und schonend gemischt, 1 Minute lang in einer Tischmikrozentrifuge gedreht und sofort 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, um die supercoiled dsDNA der Eltern zu verdauen.
5. Transformation von Bakterienzellen
- Tauen Sie die superkompetenten XL1-Blue Zellen (siehe Materialtabelle) vorsichtig auf Eis auf. Um jede Kontroll- und Probenreaktion umzuwandeln, aliquotieren Sie die superkompetenten Zellen (50 μl) in ein vorgekühltes Polypropylen-Rundbodenröhrchen (14 mL).
- Übertragen Sie 1 μL der mit Dpn I behandelten einzelsträngigen DNA (ssDNA) aus jeder Kontroll- und Probenreaktion (mutierte ssDNA) auf separate Aliquots der superkompetenten Zellen, die den komplementären Strang synthetisieren. Die Transformationsreaktionen vorsichtig schwenken, um sie zu mischen und 30 Minuten lang auf Eis zu inkubieren
Anmerkung: Vor dem Transfer der mit Dpn I behandelten DNA in die Transformationsreaktion wird empfohlen, das restliche Mineralöl vorsichtig von der Pipettenspitze zu entfernen. Als optionale Kontrolle muss die Transformationseffizienz der superkompetenten XL1-Blue-Zellen überprüft werden, indem 0,1 ng/μl des pUC18-Kontrollplasmids (1 μl) mit einem 50 μl Aliquot der superkompetenten Zellen gemischt werden.
- Wenden Sie einen Wärmeimpuls auf die Umwandlungsreaktionen bei 42 °C für 45 s an und legen Sie die Reaktionen dann für 2 Min. auf Eis
Anmerkung: Der angelegte Wärmeimpuls wurde bereits für die genannten Bedingungen in Polypropylen-Rundbodenröhrchen (14 mL) optimiert.
- Fügen Sie 0,5 ml NZY+-Brühe hinzu (enthält pro Liter: 10 g neuseeländisches Amin (Kaseinhydrolysat), 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 12,5 ml 1 M MgCl2, 12,5 ml 1 M MgSO4, 10 ml 2 M Glukose, pH 7,5 und auf 42 °C vorgeheizt) und inkubieren Sie die Umwandlungsreaktionen bei 37 °C unter Schütteln bei 225-250 U/min für 1 h. jede Transformationsreaktion (5 μl aus der Kontrollplasmidtransformation; 250 μl aus der Probentransformation) auf LB-Ampicillin-Agarplatten.
Anmerkung: Für die Transformationskontrollen und die Mutagenese verteilen sich die Zellen auf LB-Ampicillin-Agarplatten mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal, 80 μg/ml) und Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (IPTG, 20 mM) (siehe Materialtabelle). Beimpfen Sie 50 ml der Zellkulturen mit einer einzigen Kolonie transformierter E. coli-Zellen, um mutierte Plasmid-DNA für Analysen aufzureinigen. Die Mutagenese wird durch DNA-Sequenzierung an einer externen Einrichtung bestätigt.
6. Expression und Proteinreinigung
- Für eine großtechnische Kultur inokulieren Sie eine kleine Menge LB (mit Ampicillin) mit einer einzigen Kolonie aus der transformierten Platte.
- Unter Verwendung der Übernachtkultur wird die Expressionskultur mit Zusatzstoffen wie 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 und 20 mM Glukose beimpft, wobei die Samenkultur auf 1/100 verdünnt wird.
- Züchten Sie die Zellen unter kräftigem Schütteln bei 37 °C. Züchten Sie die Zellen auf einen Abs von 600 nm zwischen 0,4 und 0,6 nm (Mid-Log-Phase), bevor Sie die Zellen auf 20 °C abkühlen. Induzieren Sie mit 1 mM IPTG und wachsen Sie über Nacht.
- Ernten Sie dann die Zellen, indem Sie sie 15 Minuten lang bei 4.000 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette entsorgen.
- Das Zellpellet in phosphatgepuffertem Kochsalzpufferpuffer (PBS) resuspendieren und bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C erneut zentrifugieren. Entsorgen Sie dann den Überstand mit einer Pipette. Das restliche Pellet wird in 10 mL Lysepuffer resuspendiert und die Suspension 1 h lang bei 37 °C inkubiert.
Anmerkung: Zusammensetzung des Lysepuffers: (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 2 % Triton-X 100, 500 ng/ml Lysozym, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM Dithiothreitol, 1 mM MgCl2, pH 8, siehe Materialtabelle).
- Die Mischung zwei Gefrier-Tau-Zyklen (-80 °C) unterziehen. Trennen Sie lösliche und unlösliche Fraktionen durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 15 min bei 4 °C und analysieren Sie sie mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), insbesondere Natriumdodecylsulfat (SDS)-PAGE (Abbildung 1B, C).
Anmerkung: Zellen können auf verschiedene Arten lysiert werden, z. B. durch Gefrier-Auftauen, Beschallung, Homogenisierung, enzymatische Lyse oder eine Kombination dieser Methoden. Die Reinigung aus Einschlusskörpern wird empfohlen, um hohe Proteinausbeuten zu erzielen.
- Aufreinigung von Proteinen mittels Ni-NTA-Säulenchromatographie (siehe Materialtabelle). Laden Sie die lösliche Fraktion auf eine regenerierte Ni-NTA-Bead-Säule (1 ml/min). Waschen Sie das System mit TBS-Puffer (50 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,5), bevor Sie einen Gradienten (0-100 % 500 mM Imidazol in TBS über 60 min) starten und Fraktionen (1 mL/min) sammeln. Dialysieren Sie die gereinigten Proteine für die biochemische Charakterisierung gegen 100 mM PBS (Abbildung 1C, D).
- Alternativ können Sie His-Select Ni2+ Affinitätsgel (siehe Materialtabelle) in 14-ml-Röhrchen verwenden, um his-markiertes rekombinant exprimiertes CV-N in Pufferlösungen mit 20 mM Imidazol bzw. 250 mM Imidazol zu binden und wieder zu suspendieren. In Batch mindestens 30 Min. inkubieren
Anmerkung: Wenden Sie diese halbgereinigten Proteine auf eine vorgepackte Einwegsäule für den Pufferaustausch und die Reinigung biologischer Proben, z. B. Kohlenhydrate und Proteine, auf, die 1-1,5 mL Eluat aus der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie laden können.
- Die Proteinlösungen werden in Zentrifugationsröhrchen mit einem 10 kDa Sperrfilter umgefüllt (siehe Materialtabelle) und durch Zentrifugieren für 10 min bei 4.500 x g und 4 °C konzentriert. Für SPR-Messungen tauschen Sie die Analytlösungen gegen 10 mM HEPES, 150 mM Natriumchlorid, 3 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,05 % Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+) aus, siehe Materialtabelle).
- Geben Sie diesen SPR-Laufpuffer auf einen Verdünnungsfaktor von 1:10 und zentrifugieren Sie ihn viermal auf das Ausgangsvolumen für 10 min bei 4.500 x g und 4 °C.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration bei 280 nm mit einem NanoDrop UV-Vis-Spektralphotometer (siehe Materialtabelle) auf der Grundlage des berechneten Extinktionskoeffizienten (20.440 M-1 cm-1) für das Hauptprotein CVN2L0 mit einer Größe von 23.474 Da. Verwenden Sie PBS (100 mM, pH 7,0) oder SPR-Puffer als Blindwert und messen Sie die Proteinkonzentration in drei Verdünnungsstufen (1:1, 1:10 und 1:100).
7. SPR-Spektroskopie
- Als Regenerationspuffer ist das Zweikanal-SPR-System (siehe Materialtabelle) mit Laufpuffer HBS-EP(+) und 10 mM Glycin HCl pH 1,5-1,6 zu verwenden. Schalten Sie das Gerät, den Entgaser, den Autosampler und die Pumpe ein und waschen Sie das gesamte System 1 h lang mit ddH20. Geben Sie den gebrauchsfertigen Laufpuffer in eine separate Flasche.
- Tropfen Sie Immersionsöl auf den Detektor und montieren Sie einen Glassensorchip (siehe Materialtabelle), der mit einem dünnen Goldfilm beschichtet und auf der Oberseite mit Carboxymethyldextran-Hydrogel funktionalisiert ist, direkt auf den Detektor unterhalb der Durchflusszelle mit drei Anschlüssen. Korrigieren Sie die Einstellung, indem Sie die Taste handling.
Anmerkung: C19RBDHC30M 200 nm Streptavidin-derivatisiertes Carboxymethyldextran-Hydrogel mit einer mittleren Dichte an biotinyliertem Coronavirus-2-RBD-Protein für das schwere akute respiratorische Syndrom ist ein gebrauchsfertiger Sensorchip mit dem präimmobilisierten Liganden.
8. SPR-Bindungsassay für die CV-N-Bindung an HA, S-Protein und RBD
- Immobilisieren Sie die proteinhaltigen Liganden auf Sensorchips, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Öffnen Sie eine Lauftabelle, indem Sie in der Menüleiste auf Formular und in der integrierten SPRAutoLink-Software auf Run-Tabelleneditor klicken (siehe Materialverzeichnis). Wählen Sie BASIC_Immobilization aus der Liste der verfügbaren Lauftabellen aus und klicken Sie auf und folgen Sie den Schritten des experimentellen Verfahrens auf dem Computerbildschirm. Der jeweils verwendete Sample-Editor wird in der rechten oberen Ecke angezeigt.
- Klicken Sie im Abschnitt Formular auf Sample Set Editor, um die Reagenzienliste für zwei Racks auszufüllen, die im Autosampler für weitere Analysen platziert wurden. Klicken Sie in der Menüleiste auf Autosampler Direct Control als "Tool", um die Racks nach vorne oder hinten nach Hause zu bringen. Wählen Sie 4 °C als Betriebstemperatur.
Anmerkung: Die SPR-Software ermöglicht "SPR Instrument Direct Control" und "Pump Direct Control" durch Auswahl der entsprechenden Werkzeuge sowie Autosampler-Handling und durch Klicken auf Formular; Für die Datenanalyse können auch Tabelleneditor ausführen, Datendiagramm oder Nachbearbeitung ausgewählt werden. Dateien werden direkt im Standardverzeichnis gespeichert und als scrubber.files aus dem Fenster Nachbearbeitung exportiert.
- Starten Sie die Pumpe zum Aufgießen von ddH20 mit einem Klick auf Tools und Pump Direct Control und zeichnen Sie die Daten auf, indem Sie auf SPR Instrument Direct Control klicken und jedes Mal Start in den neu erscheinenden Fenstern drücken. Geben Sie die Koppelreagenzien (Schritt 8.3) in 300-μl-Fläschchen, legen Sie sie in die Autosampler-Racks und starten Sie die Lauftabelle mit einem Klick auf Ausführen.
Anmerkung: Die Chipoberflächen werden entweder mit 10 mM Glycinpuffer pH 9,0 konditioniert oder mit 1 M Natriumchlorid, 0,1 M Natriumboratpuffer pH 9,0 gespült, um die Carboxyl-derivatisierte Chipoberfläche für den EDC/NHS-Aktivierungsmix zu konditionieren.
- Für diese einfache Protein-Protein-Wechselwirkung verwenden Sie den CMD500D-Chip (siehe Materialtabelle), um eine Mikrobrechungsindexeinheit (μRIU) = 2500 - 3000 Flusszelle mit immobilisiertem HA und μRIU = 400 Flusszelle mit Spike-Protein zu erzeugen. Bei einer Infusionsflussrate von 15 μl/min injizieren Sie ein wässriges und gleiches Gemisch aus 0,4 M N-Ethyl-N'-(Dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (EDC*HCl) und 0,1 M N-Hydroxysuccinimid (NHS), indem Sie die folgenden aufeinanderfolgenden Schritte anwenden.
- Füllen Sie die Pumpe mit 25.000 μl/min nach, führen Sie eine Basiseinstellung für 30 s durch, injizieren Sie 90 μl Probenaktivierungslösung (EDC/NHS) über eine Kontaktzeit von 6 Minuten und halten Sie sie dann für weitere 5 Minuten.
- Wiederholen Sie diesen Zyklus nach dem Ausgangswert, der 1 Minute lang bei 10 μl/min nur auf der linken Flusszelle (blau) ausgeführt wurde, um chemisch synthetisierte Peptide, HA und Spike-Protein bei 20 μg/ml zu injizieren und zu immobilisieren, und lassen Sie die anschließende Baseline-Anpassung mit ddH2O für 1,5 min zu, bevor Sie die aktivierte Chipoberfläche mit 1 M Ethanolamin HCl pH 8,5 abschrecken.
- Schalten Sie die Röhrchen vom Flüssigprobenehmer auf den Entgaser von ddH20 in die Flasche mit HBS-EP(+) um (Bild 2).
- Analysieren Sie die SPR-Sensorgramme.
- Um kinetische Studien durchzuführen, verwenden Sie verschiedene Analytkonzentrationen (10-5-10-8 M), mit einem Regenerationsschritt nach jeder Injektion und Blindmessungen nach verschiedenen Analyten. Ändern Sie die Flussrate auf 10 μl/min und beginnen Sie die Injektionen für eine Kontaktzeit von 4 Minuten, dann eine Basisliniengenerierung von 5 Minuten und zwei Regenerationsschritte von jeweils 2 Minuten mit einem Intervall von 30 s.
- Injizieren Sie die Pufferlösung für Blindmessungen, bei denen Sensorgramme von den Probenläufen abgezogen werden, um unterschiedliche Proteinkonzentrationen zu normalisieren.
- Klicken Sie auf Formular, scrollen Sie nach unten und wechseln Sie zu "Nachbearbeitung", indem Sie auf diesen Betriebsmodus klicken. Klicken Sie auf Hinzufügen, um die im Zeitverlauf im Datendiagramm generierten Bindungskurven für jede Flusszelle auszuwählen und das Overlay als Scrubber-Datei (.ovr) zu exportieren. Klicken Sie auf Datei, um die Optionen zum Speichern von Dateien zu öffnen. Erhalten Sie Antwortkurven, indem Sie die linke und rechte Kurve ausrichten und die Signale des zweiten Referenzkanals von denen des Ligandenkanals subtrahieren.
Anmerkung: Die Daten werden im "Post-Processing" betrieben, indem Sensorgramme rechnerisch definiert werden. Es wird in eine Überlagerung von Sensorgrammen von linken und rechten Durchflusszellen eingefügt oder als Sensorgramme aus der Differenz beider Kanäle dargestellt.
- Reinigen Sie die gesamte Fluidik mit 50-100 mM Glycinpuffer pH 9,5, Wasser und 20 % Ethanol vor und nach den Bindungsmessungen, um Spuren von Salz oder Proteinverunreinigungen zu entfernen, oder strenger, mit 0,5 % SDS und Glycin.
Anmerkung: Um Schäden am Instrument zu vermeiden, wird empfohlen, die mechanische Stabilität des Glaschips zu überprüfen, bevor die Chippatrone wieder in das Instrument eingesetzt wird, wenn die Chips unter einem Puffer oder bei 100 % Luftfeuchtigkeit gelagert wurden.
Tabelle 1: Kinetische Daten aus SPR-Sensorgrammen für die Bindung von CVN2L0 und Cys-Cys-Bindungsvarianten V2, V4 und V5 an HA unter Verwendung eines Langmuir 1:1-Bindungsmodells. KD [M] = kaus/kan oder kd/ka. Alle Daten werden bei 25 °C im HBS-EP(+)-Puffer erzeugt.
| Analyt | kauf [M-1*s-1] | kaus [S-1] | KD |
| CVN2L0 | 5.1 e3 | 1.3 e-3 | 255 nM |
| V2 | 4.0 e3 | 1.1 E-3 | 275 nM |
| Nr. V4 | 1.2 e3 | 1.3 e-3 | 11 μM |
| V5 | 1.2 e3 | 5.8 E-2 | 5 μM |
