Kernspinresonanz zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen auf atomarer Ebene

Zusammenfassung

Quelle: Winkelaar, G., et al. Messung der Wechselwirkungen von globulären und filamentösen Proteinen mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) und mikroskaliger Thermophorese (MST). J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt die Kernspinresonanzspektroskopie-Technik zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen ¹⁵N-markierten Wildtyp- und mutierten Envoplakin-Proteinen und dem unmarkierten Vimentin-Protein. Die erfolgreiche Interaktion zwischen Wildtyp-Envoplakin und Vimentin führt zu einer großflächigen Linienverbreiterung und zum Verschwinden von Peaks in den NMR-Spektren, während das Fehlen einer Wechselwirkung zwischen dem mutierten Envoplakin und Vimentin zu gut aufgelösten Peaks in den NMR-Spektren führt.

Protokoll

1. NMR-Methoden

1. Vorbereitung von NMR-Proben
   1. Aufreinigung von ¹⁵N-markiertem Wildtyp- oder R1914E E-PRD-Protein mit 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7. Proteinstammlösungen reichen normalerweise von 0,3 bis 1 mM mit Volumina von etwa 1 ml.
      Anmerkung: Das Protein kann mit einem MWCO 3 kDa, 5 mL Zentrifugal-Ultrafiltrationsgerät auf >100 μM konzentriert werden, um die Konzentration in einen geeigneten Bereich für die Probenvorbereitung zu bringen.
   2. Eine Probe des unmarkierten VimRod-Proteins wird mit 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7 gereinigt.
   3. In einem Endvolumen von 500 μl wird Wildtyp- oder mutiertes E-PRD-Protein bis zu einer Endkonzentration von 100 μM, Deuteriumoxid (_D2O) bis zu einer Endkonzentration von 10 % (v/v) und DSS (4,4-Dimethyl-4-silapentan-1-sulfonsäure) bis zu einer Endkonzentration von 20 μM zugegeben. Das Probenvolumen wird mit 20 mM Tris-HCl auf 500 μl erhöht. 1 mM DTT und pH 7. Die repräsentative Probenvorbereitung ist in Tabelle 1.
      beschrieben Anmerkung: Die 0 ppm Resonanz von DSS wird sowohl zur ^{Kalibrierung der 1}H chemischen Verschiebungen als auch zur indirekten Referenzierung der ¹⁵N chemischen Verschiebungen des Proteins verwendet. D₂O wird für das Deuterium-Lock-Signal verwendet, um das Spektrometer bei einem konstanten Nettomagnetfeld zu halten.
   4. Machen Sie eine zweite Probe aus E-PRD,_D2O und DSS wie im vorherigen Schritt und fügen Sie VimRod bis zu einer Endkonzentration von 50 μM hinzu, bevor Sie das Volumen auf 500 μl erhöhen.
   5. Übertragen Sie die 500 μL-Proben für das Experiment in 5 mm breite NMR-Röhrchen.

>2. NMR-Versuchsaufbau

1. Schalten Sie den Luftstrom mit dem Auswurfbefehl "ej" ein, um die Probe vom Magneten nach oben zu bringen. Platzieren Sie nun die Probe in einem Spinner auf dem Magneten an der Öffnung und führen Sie sie mit dem Befehl "ij" ein. Warten Sie, bis sich die Probe im Magneten abgesetzt hat, bevor Sie fortfahren.
2. Erstellen Sie einen neuen Datensatz mit dem Befehl "edc" und laden Sie die Standard-NMR-Parameter ^{von 1}H, indem Sie das Experiment "ZGPR" auswählen (Abbildung 1). Füllen Sie die Felder NAME, EXPNO (Versuchsnummer) und PROCNO (Nummer des verarbeiteten Datenordners) aus. Wählen Sie das Lösungsmittel im Feld "Lösungsmittel einstellen" aus und klicken Sie auf "'getprosol' ausführen", um den Standard-Sondenkopf und die lösemittelabhängigen (prosol) Parameter auszulesen.
3. Sperren Sie die Probe mit dem Befehl "Lock" an das deuterierte Lösungsmittel, d. h. D₂O, und warten Sie, bis sie mit dem Sweepen fertig ist und die Verriegelung erreicht hat.
4. Korrigieren Sie die Resonanzfrequenz des Magneten, indem Sie das Sample mit dem automatischen Abstimmbefehl "atma" abstimmen. Überwachen Sie die Wobble-Kurve, bis die automatische Abstimmung abgeschlossen ist.
5. Shimen Sie das Magnetfeld mit TOPSHIM (Befehl "topshim"). Shimming ist der Prozess der Anpassung eines Magnetfelds, um eine Gleichmäßigkeit um die Probe herum zu erreichen. Es empfiehlt sich, die Shim-Werte mit dem Befehl "wsh" zu speichern und sie mit "rsh" vor topshim zu lesen, wenn die gleichen oder ähnliche Beispiele verwendet werden.
6. Passen Sie die Verstärkung des Empfängers mit dem Befehl "rga" an, um ein maximales Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen.
7. Platzieren Sie die Mitte des Spektrums auf dem Wasserresonanz-Offset (o1) und stellen Sie den 90-Grad-Protonenpuls (p1) mit "calibo1p1" auf hohe Leistung ein.
8. Erfassen Sie das Protonenspektrum mit dem Null-Go-Befehl "zg" und verarbeiten Sie es mit "efp", was die exponentielle Multiplikation ("em"), den freien Induktionszerfall (FID) mit Linienverbreiterung, die "ft"-Fourier-Transformation von FID und "pk" zur Anwendung der Phasenkorrektur umfasst.
9. Wenden Sie die automatische Phasenkorrektur "apk" und die automatische Basislinienkorrektur "absn" mit der Option Polynom ohne Integration an.
10. Erstellen Sie einen neuen Datensatz (wie in 1.2.2) für das SOFAST HMQC-Experiment, indem Sie im Experiment "SFHMQC3GPPH" auswählen.
11. Kopieren Sie optimierte P1 und O1 aus dem Protonenspektrum und füllen Sie die P1-abhängigen Pulse mit dem Befehl "getprosol 1H p1 plw1", wobei p1 der optimierte P1-Wert und plw1 der Leistungspegel für P1 ist.
12. Optimieren Sie die CNST54-Konstante, um den Offset für die chemische Amidverschiebung festzulegen, und CNST55, um die Bandbreite zu definieren, um die interessierenden spektralen Bereiche zu umfassen, wodurch die Empfängerverstärkung optimiert werden kann (Abbildung 2). Um diese Parameter auszuwählen, extrahieren Sie den ersten FID (freier Induktionszerfall) aus dem zweidimensionalen Spektrum und suchen Sie nach dem beobachteten Signal, um sie zu definieren. Variieren Sie außerdem die Relaxationsverzögerung (D1), die Anzahl der Scans (NS) und die Dummy-Scans (DS), um eine akzeptable Signalempfindlichkeit mit dem Befehl "gs" zu erhalten, der es Go und Scan ermöglicht, die Datenqualität in Echtzeit zu überwachen.
13. Nehmen Sie die Spektren mit Zero Go "zg" auf.

Tabelle 1. Vorbereitung von NMR-Proben.

Probe	1 mM E-PRD in Puffer A (μL)	1mM VimRod in Puffer A1 (μL)	Puffer A (μL)	200 μM DSS in D2O (μL)	Puffer B2 (μL)	Gesamtvolumen (μL)
E-PRD allein	Nr. 50	0	Nr. 50	Nr. 50	350	500
E-PRD + VimRod	Nr. 50	Nr. 50	0	Nr. 50	350	500
1Puffer A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
2Puffer B: 23 mM Tris-HCl, 1,14 mM DTT, pH 7

Ergebnisse

Abbildung 1: Screenshot des Aufbaus des NMR-Experiments. Das gezeigte Fenster wird verwendet, um ein Standardexperiment zum Erfassen eines HSQC-Datensatzes einzurichten. Experimentparameter werden neben Experiment gelesen. Das gezeigte ZGPR-Experiment wurde als erstes Experiment gewählt, um die Standard- und lösungsmittelabhängigen Protonenparameter zu laden. Das Titelfenster wird verwendet, um ex...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ammoniumchlorid (15N, 99%)	Cambridge Isotope Laboratorien	NLM-467	Isotopenmarkierung für die NMR
D2O, Deuteriumoxid (D, 99,8 %)	Cambridge Isotope Laboratorien	DLM-2259	Vorbereitung von NMR-Proben
DSS, Natrium-2,2-dimethyl-2-silapentan-5-sulfonat-D6 (D,98%)	Cambridge Isotope Laboratorien	DLM-8206	Referenz für NMR
Präzisions-5-mm-NMR-Röhren, 7" lang	SJM/Deuterotuben	BOROECO-5-7	NMR-Röhrchen
NMR-Spektrometer (14,1 Tesla)	Bruker		Erfassung von NMR-Daten
TCI 5mm z-PFG Kryosonde	Bruker		Erfassung von NMR-Daten
Software
Bruker TopSpin 4.0.1	Bruker		Verarbeitung von NMR-Daten