Verwendung des Phagen-Displays zur Auswahl von Proteinen mit hoher Affinität zu einem Zielprotein

Zusammenfassung

Quelle: Zhang, W., et al., Using Page Display to develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video demonstrieren wir die Phagen-Display-Technik, um vorgefertigte Phagen zu isolieren, die Proteine mit hoher Affinität zum Zielprotein exprimieren.

Protokoll

1. Bereiten Sie die Phagenbibliothek vor

1. Tauen Sie die Phagenbibliothek auf Eis auf und verdünnen Sie sie auf das 100-fache der Bibliotheksvielfalt in PBS. Wenn die Bibliotheksvielfalt z. B. 1 x 10¹⁰ und die Bibliothekskonzentration 1 x 10¹³ beträgt, verdünnen Sie die Bibliothek so, dass die Konzentration 1 x 10¹² beträgt. Die hier verwendeten Bibliotheken verdünnen Sie in PBS 10-fach, indem Sie 1 mL der Bibliothek mit 9 mL PBS kombinieren.
   Anmerkung: Die Bibliotheksvielfalt sollte bei der Erstellung der Bibliothek ermittelt worden sein und kann nicht einfach anders beurteilt werden. Die Bibliothekskonzentration kann bestimmt werden, indem E. coli-Zellen in der Mid-Log-Phase (OD600 0.6 - 0.8) und Plattieren auf LB/carb
aufgetragen werden.
2. Fügen Sie 1/5 Volumen PEG/NaCl hinzu. Fügen Sie beispielsweise für 10 mL der zuvor verdünnten Bibliothek 2 mL PEG/NaCl hinzu.
3. 30 min auf Eis inkubieren.
Bei
4. 11.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugieren, Überstand verwerfen und 2 min erneut zentrifugieren, um den restlichen Überstand nach unten zu ziehen.
   Anmerkung: Setzen Sie das Rohr beim zweiten Mal in der gleichen Ausrichtung in den Rotor ein, wie es das erste Mal war, um das Pellet an der gleichen Stelle zu halten, damit es leichter zu sehen ist.
5. Resuspendieren Sie das Phagenpellet vorsichtig in 1 ml PBT pro Protein. Für vier Proteine resuspendieren Sie das Pellet in 4 ml PBT.
   Anmerkung: Versuchen Sie, das Pellet nicht zu berühren und keine Luftblasen einzuführen.

2. Zeige Phagen für das/die Zielprotein(e)

an

1. Optionale Kontrolle: Geben Sie 100 μl Phagenbibliothek in jede beschichtete Vertiefung in der Kontrollplatte. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur (~20-25 °C) für 1 h mit 300 U/min Orbitalschütteln und übertragen Sie die Bibliothek von der Kontrollplatte auf die Zielplatte.
2. Entfernen Sie den PB-Puffer von der Zielplatte und fügen Sie 100 μl der Phagenbibliothek in jede beschichtete Vertiefung hinzu.
3. Bei Raumtemperatur (~20-25 °C) für 1 h mit 300 U/min Orbitalschütteln inkubieren.

3. Eluieren um einen Phagen

1. Entfernen Sie die Phagenbibliothek und waschen Sie die beschichteten Vertiefungen viermal mit PT-Puffer. Drehen Sie die Platte um und klopfen Sie auf ein Papiertuch, um die letzten Tropfen zu entfernen.
   Anmerkung: Wenn mehrere Zielproteine auf einer Platte beschichtet sind, versuchen Sie, den Fluss aller nachfolgenden Lösungen zwischen den Vertiefungen zu minimieren.
2. Geben Sie 100 μl 0,1 M HCl in jede beschichtete Vertiefung und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 300 U/min Orbitalschütteln.
3. Neutralisieren Sie den pH-Wert, indem Sie 12,5 μl 1 M Tris-HCl (pH 11) in jede beschichtete Vertiefung geben.
4. Poolen Sie die eluierten Phagen aus allen 8 Vertiefungen in ein einzelnes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie während des Transfers auf und ab, um die Lösungen homogen zu machen, und saugen Sie die gesamte Flüssigkeit aus den Vertiefungen an.
5. Geben Sie 10 % BSA zu den gepoolten eluierten Phagen bis zu einer Endkonzentration von 1 %. Für ein typisches Elutionsvolumen von 950 μl in der ersten Runde fügen Sie 95 μl 10 % BSA hinzu. Bei 4 °C lagern. Dies ist die Ausgabe der ersten Runde.

4. Vorbereitung auf nachfolgende Auswahlrunden

1. Bereiten Sie eine Saatgutkultur für die Kultivierung des Phageninputs für die nächste Selektionsrunde vor, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
2. Beschichten Sie die Platte für die dritte Auswahlrunde wie in Schritt 1.2 mit den unten aufgeführten Änderungen.
   1. Beschichten Sie nur vier Wells pro Protein in einer 96-Well-Bindungsplatte. Verwenden Sie die Hälfte des Inhalts der Röhrchen "rund 2/3" oder "rund 4/5" für die entsprechende Runde. Verdünnen Sie den Inhalt dieser Röhrchen nach Bedarf, um zu vermeiden, dass sich Proteine aus der Lösung absetzen.
3. Bereiten Sie den Phagen-Input für die nächste Selektionsrunde vor.
   1. Verwenden Sie die Hälfte des runden ersten Ausgangs, um 3 mL Zellen der mittleren logarithmischen Phase zu beimpfen. Für einen typischen Ausgang der ersten Runde beimpfen Sie mit 500 μl des Ausgangs.
   2. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C mit 200 U/min Orbitalschütteln.
   3. M13K07-Helferphagen bis zu einer Endkonzentration von 1 x 10¹⁰ PFU/ml zugeben.
   4. Inkubieren Sie 1 h lang bei 37 °C mit 200 U/min Orbitalschütteln.
   5. Übertragen Sie die gesamten 3 ml Kultur auf 30 ml 2YT/Carb/kan. Anbau über Nacht bei 37 °C und 200 U/min Orbitalschütteln.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Axygen Mini-Röhrchensystem (0,65 ml, steril, 96/Rack, 10 Racks/Packung)	Fisher Scientific	Tel.: 14-222-198	Kunststoff-Ware
BD Difco Dehydrierte Nährmedien: LB Brühe, Müller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Vorbereitung der Platten für das Titern
Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V	BioShop Deutschland	ALB001	Puffer-Komponente
Carbenicillin-Dinatriumsalz 89,0-100,5 % wasserfrei	Millipore-Sigma	C1389-5G	Kultivierung von mit Phagenmid infizierten Zellen
Kompakter digitaler Mikroplatten-Schüttler	Fisher Scientific	Tel.: 11-676-337	Gerät
Corning Mikroplatte Aluminium-Dichtungsband	Fisher Scientific	Tel.: 07-200-684	Versiegelung von Phagenglycerin-Beständen
Dehydriertes Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Vorbereitung der Platten für das Titern
DS-11 Spektralphotometer/Fluorometer	DeNovix	DS-11 FX+	Gerät
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, unbehandelte Mikroplatte mit U-förmigem Boden	Fisher Scientific	7000133	Kunststoff-Ware
Salzsäure	Fisher Scientific	Nr. A144-500	chemisch
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemisch kompetente E. coli	Fisher Scientific	C854003	Bakterienstamm zur Phageninfektion
Kanamycin-Sulfat	Fisher Scientific	AAJ1792406	Kultivierung von M13K07-Helfer-Phagen-infizierten Zellen
M13KO7 Helfer Phagen	Neuengland Biolabore	Nr. N0315S	Erlauben Sie die Packung und Sekretion von Phagemiden
MaxQ 4000 Tisch-Orbitalschüttler	Fisher Scientific	Tel.: 11-676-076	Gerät
Nunc MaxiSorp 96-Well-Mikrotiterplatte, flacher Boden	Lebenstechnologien	Tel.: 44-2404-21	Kunststoff-Ware
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 10X Lösung	Fisher Scientific	Nr. BP3994	Pufferkomponente/Phagen-Resuspensionsmedium
Polyesterfolien für ELISA und Inkubation	VWR	Artikel-Nr.: 60941-120	Abdecken der Mikrotiterplatten während der Inkubation
Polyethylenglykol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	Nr. BP233-1	Phagen-Niederschlag
Natriumchlorid	Millipore-Sigma	Nr. S3014	Phagen-Niederschlag
Sterile Kulturröhrchen aus Kunststoff: Transluzentes Polypropylen	Fisher Scientific	14-956-1D	Kultivierung von Phagen-Inputs
Tetracyclinhydrochlorid	Fisher Scientific	Nr. BP912-100	Kultivierung von E. coli OmniMax-Zellen
Tris Basis	Fisher Scientific	Nr. BP1525	Neutralisierung von eluierter Phagenlösung
Trypton-Pulver	Fisher Scientific	Nr. BP1421-2	Komponente des Zellwachstumsmediums
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Puffer-Komponente
Hefeextrakt	Fisher Scientific	Nr. BP1422-2	Komponente des Zellwachstumsmediums