Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Homo-Oligomerisierung

1. FKBP12 F36V -mVenus Reinigung

1. Transformieren Sie (DE3) pLysS-Zellen mit einem pET22b-Vektor, der monomerisiertes humanes FKBP12F36V12 und N-terminale His6- und mVenus-Tags enthält (Vektor auf Anfrage erhältlich). Plattenzellen auf LB-Agar, ergänzt mit 50 μg/mL Ampicillin und 34 μg/mL Chloramphenicol.
2. Transformierte Völker in 100 mL LB Starterkultur überführen und 16 - 20 Stunden bei 37 °C unter Schütteln züchten.
3. Verdünnen Sie die dichte Starterkultur (OD600 >1) 1:100 in LB-Medium (2 x 500 mL Chargen) und wachsen Sie für 2 - 3 Stunden auf OD600 = 0,6 - 0,8 (37 °C, 200 U/min).
4. Coole Kulturen auf Eis. Induzieren Sie mit 250 μM IPTG und wachsen Sie 16 - 20 Stunden bei 21 °C, 200 U/min.
5. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 20 Minuten.
6. Resuspendieren Sie das Pellet in 40 mL IMAC-Puffer A (20 mM Natriumphosphat pH 7,5, 500 mM NaCl, 3 mM Imidazol, 1 mM β-Mercaptoethanol), ergänzt mit EDTA-freien Proteaseinhibitoren (1 Tablette pro Zellpellet).
7. Zellen (500 Watt, 20 kHz, 40 % Amplitude, 9 s an, 11 s aus für 15 min) auf Eis beschallen und lösliches Material durch Zentrifugation bei 20.000 x g ernten.
8. Lösliches Lysat in einen erschöpfenden Kolben überführen und 2 ml Harz zugeben (siehe Materialtabelle). 1 Stunde lang mit 105 U/min U/min inkubieren
   Anmerkung: Für diesen IMAC-Schritt kann auch Nickelsepharose verwendet werden.
9. Harz ernten und mit 250 mL IMAC-Puffer A waschen, gefolgt von 500 mL IMAC-Puffer B (20 mM Natriumphosphat pH 7,5, 500 mM NaCl, 7 mM Imidazol, 1 mM β-Mercaptoethanol).
   Anmerkung: Erhöhung auf 50 mM Imidazol bei Verwendung von Nickel-Sepharose-Harz.
10. Eluieren Sie His6-markiertes Protein mit IMAC-Puffer C (20 mM Natriumphosphat pH 7,5, 500 mM NaCl, 300 mM Imidazol, 1 mM β-Mercaptoethanol).
11. Auf eine Größenausschlusssäule (siehe Materialtabelle) injizieren, die in 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl und 1 mM DTT äquilibriert ist. FKBP12F36V hat seine maximale Elution bei 87,71 mL auf der von uns verwendeten Säule.
12. Beurteilen Sie die Reinheit über SDS-PAGE und poolen und konzentrieren Sie nach Bedarf.

2. Vorbereitung des Multiwell-Plattenarrays

1. Tauen Sie das gereinigte FKBP12F36V (oder das markierte Protein von Interesse) bei -80 °C auf.
2. Bereiten Sie eine Lösung mit 100 nM gereinigtem FKBP12F36V vor (Medium, 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Beschallung und Zentrifuge (schnelles Schleudern von 13.000 U/min), um die Bildung von Zuschlagstoffen zu verhindern.
3. Pipettieren Sie 100 - 200 μl in eine 8-Well-Beobachtungskammer mit Glasboden.
4. Fügen Sie den BB-Dimerizer zu Endkonzentrationen von 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 und 500 nM hinzu.
5. Bereiten Sie als Referenz eine Lösung von 100 nM mVenus allein her, um potenzielle Aggregations- und Ausfällungseffekte zu bewerten und einen Helligkeitswert für das Monomer mit denselben Erfassungseinstellungen wiederherzustellen.

3. Kalibrierungsfreie konfokale Erfassung

1. Starten Sie das konfokale System (Abbildung 1). Jedes konfokale Licht-Scanning-Mikroskop-System, das mit digitalen Detektoren oder gut charakterisierten analogen Detektoren ausgestattet ist und in der Lage ist, eine konstante Verweilzeit für jedes erfasste Pixel zu halten, würde funktionieren.
2. Stellen Sie den Anregungsstrahlengang ein:
   1. Schalten Sie den 514-nm-Laser ein und stellen Sie ihn am Ausgang des Objektivs auf 20 - 100 nW Leistung ein (für FKBP12F36V-mVenus).
   2. Wählen Sie das 63X1,4NA-Objektiv oder ein für FCS entwickeltes Wasserimmersionsobjektiv zur Kragenkorrektur.
   3. Schalten Sie einen HyD-, APD- oder kalibrierten PMT-Detektor ein. Detektoren, die in der Lage sind, Photonen zu zählen, sind vorzuziehen, da in diesem Fall die Berechnung von S, Offset und σ₀² nicht erforderlich ist.
   4. Wählen Sie das Emissionsfenster von 520 - 560 nm
   5. Stellen Sie die Lochblende auf 1 Airy-Einheit für die entsprechende Emission ~545 nm ein.
   6. Stellen Sie den Aufnahmemodus auf 16 x 16 Pixel ein
   7. Stellen Sie die Verweilzeit des Pixels t_so ein, dass sie t_frame >> T_D >> t_dwell erfüllt, wobei T_D die Verweilzeit des diffundierenden Proteins und t_frame die Bildrate ist. Dies entsprach einer Einstellung der Verweilzeit auf ~13 μs.
      Anmerkung: Einige kommerzielle Hersteller hatten Scanner, die die Verweilzeit pro Pixel nicht konstant hielten. Diese Konstanz ist entscheidend dafür, dass die Methode funktioniert.
   8. Stellen Sie die Pixelgröße auf ~120 nm ein.
   9. Wählen Sie den xyt-Aufnahmemodus und wählen Sie die Anzahl der Frames aus, die pro Aufnahme und Well erfasst werden sollen (z. B. 5.000).
   10. Wenn das System mit einem Hochdurchsatzmodus ausgestattet ist, geben Sie die Koordinaten jeder Vertiefung und die Anzahl der Erfassungen pro Vertiefung ein, um den Prozess zu automatisieren.
       Anmerkung: Achten Sie darauf, dass ein Wasserspender vorhanden ist, wenn Sie ein Immersionsobjektiv verwenden.
   11. Wenn das System mit einem Perfusionssystem ausgestattet ist, laden Sie die BB-Lösung und programmieren Sie die Perfusion so, dass sie direkt nach dem⁵⁰⁰⁰. Frame beginnt, um die Kinetik der Dimerisierung bei der Aufnahme von z.B. 10.000 Bildern zu bewerten.
3. Geben Sie einen Tropfen Öl in das Öl-Immersionsobjektiv/Wasser, wenn Sie ein für FCS entwickeltes Kragenkorrektur-Wasserimmersionsobjektiv verwenden.
4. Montieren Sie die 8-Well-Beobachtungskammer auf der Bühne.
5. Wählen Sie die richtige Vertiefung aus und konzentrieren Sie sich auf die Lösung.
   Anmerkung: WICHTIG: Vermeiden Sie es, in der Nähe des unteren Glases zu fokussieren, um Reflexionen und Streuungen zu vermeiden. Wenn Sie sich tiefer auf die Lösung konzentrieren, trennen Sie die Option für die automatische Fokussierung.
6. Starten Sie die Aufnahme und speichern Sie den resultierenden Bildstapel im TIFF-Format.

4. Detrend- und Helligkeitsanalyse mit dem R-Paket nandb

1. Als Qualitätsprüfung vor der Verarbeitung verwenden Sie ImageJ, um einen Blick auf die Bilder zu werfen und das Intensitätsprofil wiederherzustellen, wie in Abbildung 2a gezeigt. Dies ist nützlich, um festzustellen, ob zu viel Photobleaching stattgefunden hat oder nicht. Kommt es zu viel Bleaching, sind die Daten für eine weitere Analyse nicht geeignet.
   Anmerkung: ImageJ kann auch nützlich sein, um Bilder aus kommerziellen Formaten in TIFF zu konvertieren. Die unten beschriebene nandb-Software kann nur mit TIFF-Dateien arbeiten.
2. Laden Sie R und RStudio herunter, und installieren Sie es. Es empfiehlt sich, zuerst R herunterzuladen und zu installieren, dann RStudio.
   Anmerkung: Im Folgenden wird beschrieben, wie das nandb R-Paket verwendet wird. Kenntnisse der Sprache R sind für die Verwendung von nandb nicht erforderlich, es wird jedoch das Leben erleichtern.
3. Installieren Sie das nandb-Paket.
   1. Öffnen Sie RStudio, geben Sie in der Konsole install.packages("nandb") ein und warten Sie auf die Installation.
4. Lernen Sie nandb kennen
   1. Lesen Sie das Handbuch.
   2. Überprüfen Sie die integrierte RStudio-Hilfe für verschiedene Funktionen. Die wahrscheinlichste Funktion, die verwendet wird, ist brightness(). Zeigen Sie die Hilfedatei für diese Funktion an, indem Sie ? brightness() an der Konsole.
5. Helligkeit berechnen
   1. Nehmen wir an, man hat eine Bilddatei auf dem Desktop mit dem Namen img001.tif (beachten Sie, dass 'nandb' nur mit TIFF-Dateien funktioniert). Man kann die Helligkeit dieses Bildes berechnen:
      b <- Helligkeit("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
      1. Dadurch wird die Helligkeit des Bildes der Variablen b in R zugewiesen. Das tau = "auto" stellt sicher, dass das Bild vor der Helligkeitsberechnung korrekt enttrendet wird. Die gebräuchlichste Vorgehensweise von hier aus ist die Berechnung der mittleren oder mittleren Helligkeit des Bildes. Man kann dies tun, indem man mean(b) oder median(b) eingibt. Man kann das Helligkeitsbild auch auf dem Desktop mit
         schreiben. ijtiff::write_tif(b, "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. Nehmen wir an, man hat einen Ordner voller Bilder auf dem Desktop, die auf dem Desktop images_folder, und man muss die Helligkeiten dieser Bilder berechnen und die Helligkeitsbilder als TIFF-Dateien schreiben. Dann siehe ?brightness_folder(). Diese Funktion verarbeitet einen ganzen Ordner auf einmal:
      brightness_folder("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
      Dies ist besonders gut für diejenigen, die eine Software haben, die sie R vorziehen, da alle Dateien in einem einzigen Befehl verarbeitet werden, und dann kann man mit den Ausgabehelligkeits-TIFF-Bildern in der von ihnen gewählten Software weiterarbeiten, sei es ImageJ, Python oder etwas anderes.

Abbildung 1. Anwendung von N&B zum Nachweis von Proteinmonomer-Dimer-Übergängen in Lösung. (a) Vereinfachter optischer Weg eines Laser-Scanning-Mikroskops (LSM), das mit einer Laserquelle (eingestellt auf 514 nm im Falle von mVenus-markierten Proteinen) ausgestattet ist, die auf ein Immersionsobjektiv (in unserem Fall ein 63X1,4NA-Öl) gerichtet ist (blaue Pfeile), das eine 100-nM-Lösung von FKBP12F36V-mVenus-Lösung beleuchtet. Die Emissionsfluoreszenz (grüne Pfeile) durchläuft einen dichroitischen Spiegel und wird auf einen Bandpassfilter gerichtet, der das Emissionslicht reinigt, und auf eine Lochblende, die auf 1 Airy-Einheit eingestellt ist und sich direkt vor einem digitalen Punktdetektor befindet, der Photonen zählen kann. (b) Ein konfokales Beleuchtungsvolumen wird durch 16 x 16 Pixel abgetastet, wobei einzelne FKBP12F36V-mVenus-Moleküle beleuchtet werden, die in das Gaußsche konfokale Volumen eintreten und es verlassen, wodurch eine Reihe von Fluoreszenzintensitätsschwankungen erzeugt wird. c) Bildserien, die im Laufe der Zeit aufgenommen wurden

Abbildung 2. Die automatische Trendentfernung ist erforderlich, um eine Population von Monomeren in Lösung genau zu messen. a) Es wurde ein Stapel von 5000 Bildern mit einer Auflösung von 16 x 16 Pixeln aufgenommen, wie im Abschnitt Protokoll beschrieben. Die Intensität des ersten Frames wird zusammen mit dem durchschnittlichen zeitaufgelösten Intensitätsprofil dargestellt, das langfristige Schwankungen zeigt, die mit dem Bleichen und anderen Lösungsmittel- und/oder photophysikalischen Effekten zusammenhängen könnten. Was auch immer die Ursache für diese langfristigen Schwankungen ist, sie wirken sich auf die Helligkeitsberechnungen aus und erfordern daher eine Trendentfernung. Ohne automatischen Trendverlust erhält man B = 1,026, während nach automatischer Trendentfernung B = 1,005 ist. Auch die Helligkeit ohne (linkes Panel, zweite Reihe) und mit (rechtes Panel, zweite Reihe) glatter Filterung wird angezeigt. b) Die gleichen Daten wie unter Buchstabe a) wurden trendbereinigt und die Ergebnisse in Bezug auf Intensität und Helligkeit dargestellt.