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1. Klonen
- Bestimmen Sie die zu klonenden Konfigurationen, und wählen Sie einen Linker aus. Markieren Sie Proteine mit den Fragmenten am N- oder C-Terminus, wie unten beschrieben, damit sie ihre korrekte Lokalisierung nicht stören. Verwenden Sie einen flexiblen Linker, z. B. (GGGGS)x2.
- Markieren Sie die Proteine, die für die PAmCherry1-Fragmente von Interesse sind, genetisch. Als eine Option können Sie die in der Materialliste aufgeführten Klonierungsplasmide verwenden, die die Fragmente RN (PAmCherry1-Reste 1-159) und RC (Met plus PAmCherry1-Reste 160-236) mit flankierenden MCS-Sequenzen enthalten.
- Linearisieren Sie die Plasmide, die die Fragmente RN und RC enthalten, mit inverser PCR (oder Restriktionsverdau) am Punkt der Insertion. Primer für die inverse PCR sind in Tabelle 1 aufgeführt. Nachfolgend finden Sie ein Beispiel für ein PCR-Protokoll, das im Labor des Autors verwendet wird (siehe Materialliste für die genauen Materialien, die in diesem Protokoll verwendet werden).
- Mischen Sie die PCR-Reaktion zusammen und bringen Sie ein Endvolumen von 50 μl mit Wasser auf: In ein dünnwandiges PCR-Röhrchen geben Sie das Wasser, 25 μl des 2x Mastermix, je 0,5 μl der Vorwärts- und Rückwärtsprimer (20 μM verdünntes Material, 0,2 μM Endkonzentration) und 1 ng Template. Verwenden Sie die folgenden Zyklusbedingungen: 98 °C für 30 Sekunden, 30 Zyklen von 98 °C für 7 Sekunden und 68 °C für 2 Minuten und eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 10 Minuten.
- PCR der Gene, die für die Insertion in die linearisierten Plasmide mit RN- und RC-Fragmenten von Interesse sind. Führen Sie die PCR wie in Schritt 1.2.1 mit einer Verlängerungszeit bei 68 °C durch. Verwenden Sie Primer mit Überhängen, die eine flexible Linkersequenz enthalten, wie z. B. GGAGGTGGAGGTAGTGGGGAGGTGGAAGT für (GGGGS)x2, und 15-Basenpaar-Homologie an den Enden der linearisierten RN- und RC-Plasmide für die Rekombination.
Anmerkung: Die Primerüberhänge für die interessierenden Proteine sind in Tabelle 2 dargestellt, wenn die Primer in Tabelle 1 zur Linearisierung des Plasmidrückgrats verwendet werden.
- Verdauen Sie die PCR-Reaktion mit Dpn1, um das PCR-Template zu eliminieren. Fügen Sie 0,5 μl Dpn1 (20 U/μl) direkt zu den 50 μl der PCR-Reaktion hinzu. 1 Std. bei 37 °C inkubieren und 20 Min. bei 80 °C hitzeinaktivieren. Wenn die Hintergrundvorlage in späteren Schritten bestehen bleibt, erhöhen Sie die Enzymmenge oder verlängern Sie die Verdauungszeit.
- Aufreinigen Sie die PCR-Produkte über eine Spin-Säule, wie vom Hersteller beschrieben.
- Führen Sie eine ligationsunabhängige Reaktion durch, um ein linearisiertes Plasmid, das ein RN- oder RC-Fragment enthält, mit dem interessierenden Gen zu kombinieren. Messen Sie die Konzentration der gereinigten PCR-Produkte: Kombinieren Sie 50 ng linearisiertes Plasmid und 50 ng des interessierenden Gens mit 1 μl Enzymvormischung und bringen Sie das Gesamtvolumen mit deionisiertem Wasser auf 5 μl. 15 Minuten bei 50 °C inkubieren, auf Eis legen und 20 μl TE-Puffer hinzufügen.
- Verwandeln Sie rekombinante Plasmide in kompetente Bakterien.
- Wählen Sie 2-4+ (je nach Wunsch) Kolonien für die O/N-Kultur aus. 5 ml LB-Bouillon und 5 μl Kanamycin (50 mg/ml Stamm) werden in ein 14-ml-Polypropylen-Rundbodenröhrchen gegeben und die ausgewählte Bakterienkolonie mit einer sterilisierten Impföse zugegeben. Inkubieren bei 37 °C O/N unter Schütteln bei 225 U/min.
- Frieren Sie 1 ml O/N-Kultur für Glycerinbrühe ein und bereiten Sie den Rest wie vom Hersteller beschrieben vor.
- Führen Sie eine Sequenzierung durch, um einen guten Klon zu bestimmen. Bei Verwendung der Klonierungsplasmide in der Materialliste sind je nach Bedarf M13-Vorwärts- und Rückwärtsprimer (in getrennten Reaktionen) zu verwenden, um die vollständige Sequenz des Fusionskonstrukts zu erhalten. Vergleichen Sie mit der erwarteten Sequenz mit einem Alignment-Tool wie BLAST vom National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Übertragen Sie die sequenzverifizierten Konstrukte über eine Rekombinase-Reaktion auf ein Expressionsplasmid.
- Geben Sie 75 ng des Zielplasmids – z. B. pcDNA für transiente Transfektionen oder pLenti für lentivirale Verpackungen – und 50 ng des rekombinanten Klonierungsplasmids zu 1 μl Enzymvormischung hinzu und erhöhen Sie das Gesamtvolumen mit deionisiertem Wasser auf 5 μl. 1 Stunde lang bei 25 °C inkubieren, dann 5 μl TE-Puffer zugeben.
Anmerkung: Verwenden Sie für die lentivirale Verpackung und die Generierung stabiler Zelllinien für jedes Konstrukt ein anderes Zielplasmid, z. B. eines mit Puromycin-Resistenz und das andere mit Neomycin. Dies ermöglicht eine doppelte Auswahl der transduzierten Zellen. Berücksichtigen Sie auch den Promotor für jeden, wie z. B. den konstitutiven Cytomegalievirus (CMV)-Promotor für hohe Expressionsniveaus oder CMV mit dem TetO-Operator für eine einstellbare Doxycyclin-regulierte Expression.
- Verwandeln Sie 5 μl in kompetente Bakterien und miniprep Sie die Plasmide wie in den Schritten 1.2.6 bis 1.2.8, jedoch mit dem geeigneten Antibiotikum (typischerweise Ampicillin).
- Bestimmen Sie die optimale BiFC-Konfiguration.
- Co-transfizieren Sie Expressionsplasmide in U2OS-Zellen (oder eine Zelle der Wahl).
- Geben Sie 350 μl phenolrot- und antibiotikafreies DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, in jede Vertiefung eines 8-Well-Objektträgers #1,5 mit Glasboden. Plattieren Sie etwa 7,5 x 104 Zellen pro Well, so dass die Zellen am nächsten Tag zu etwa 70 % bis 90 % konfluent sind.
- Am Tag nach der Beschichtung werden Expressionsplasmide mit unterschiedlichen Konfigurationen in jeder Vertiefung unter Verwendung des bevorzugten Reagenzes und wie vom Hersteller beschrieben co-transfiziert.
- Für jede Vertiefung werden 125 ng jedes Expressionsplasmids in 50 μl serumfreies reduziertes Medium in ein 0,6-ml-Röhrchen gegeben und zum Mischen auf und ab pipettiert. Geben Sie 1 μl des Transfektionsreagenzes in die Mitte des Röhrchens und direkt in das Medium. Vorsichtig umrühren, um zu mischen, und die Reaktion 30 Minuten ruhen lassen.
- Reduzieren Sie das Medium in jeder Vertiefung des Kammerschiebers um etwa die Hälfte. Die Transfektionsmischung tropfenweise in die Vertiefungen geben und vorsichtig schütteln, um sich zu vermischen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 für 24-48 Stunden. Wechseln Sie das Medium am Tag nach der Transfektion.
- Abbildung von Zellen auf einem Fluoreszenzmikroskop wie in Protokoll 2 beginnend mit Schritt 2.1.4.
Anmerkung: Die Probe kann mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden, wenn die Expressionswerte hoch sind und die Kamera empfindlich genug für die relativ geringe Photonenleistung von PAmCherry1 ist. Rekonstituierte PAmCherry1-Moleküle können mit einem Ultraviolett-Filterset (405 nm) aktiviert werden, bevor sie mit einem grünen Anregungsfilterset (561 nm) abgebildet werden.
- Schaffen Sie gegebenenfalls eine Negativkontrolle, indem Sie z. B. eine Punktmutation in eines der interessierenden Proteine einführen, die die Interaktion stört. Durchführung einer ortsgerichteten Mutagenese am Klonierungsplasmid des zu mutierenden Proteins und der gewählten Konfiguration.
- Generieren Sie eine stabile Zelllinie, indem Sie die Konstrukte in virale Partikel verpacken und U2OS-Zellen (oder eine Zelllinie Ihrer Wahl) infizieren. Erwägen Sie ein induzierbares (Tetracyclin-)Expressionssystem, damit die Expression vor der Bildgebung induziert werden kann, wenn eine anhaltende Irreversibilität von BiFC ein Problem darstellt oder wenn eine einstellbare Expression gewünscht wird.
Vorsicht: Die Arbeit mit Viren ist als Biosicherheitsstufe 2 eingestuft. Obwohl die jüngsten Generationen von Virusverpackungssystemen die Wahrscheinlichkeit, replikationsfähige Viren zu produzieren, stark verringert haben, sind einige Risiken immer noch vorhanden. Referenzen finden Sie unter http://www.cdc.gov/ biosafety/publications/.
- Wiederholen Sie Schritt 1.2.10 mit einem lenti- oder retroviralen Zielvektor. Erhöhen Sie die O/N-Kultur auf 100 ml, um einen Midiprep und eine höhere Reinheit der Plasmide
zu erzielen.
- An Tag 1: Für jedes zu verpackende Konstrukt ca. 2 x 106 293T/17 Zellen in eine 10 cm große Schale geben.
- An Tag 2: Bereiten Sie eine Transfektionsreaktion mit einem Transfektionsreagenz Ihrer Wahl und wie vom Hersteller beschrieben vor.
- Es wird eine Vormischung aus Verpackungsplasmiden mit Endkonzentrationen von 250 ng/μl für die Verpackung der Plasmide 1 und 2 und von 100 ng/μl für die Verpackung von Plasmid 3 in sterilem Wasser hergestellt. 10 μl der Packungsplasmid-Vormischung und 2,5 μg des Zielplasmids in 1 ml serumfreies reduziertes Medium in ein 5-ml-Polypropylen-Rundbodenröhrchen geben und zum Mischen nach oben und unten pipettieren. Geben Sie 20 μl Transfektionsreagenz in die Mitte des Röhrchens und direkt in das Medium.
- Vorsichtig zum Mischen rühren und 30 Minuten bei RT inkubieren. Etwa die Hälfte des Mediums aus den Zellen entfernen und die Transfektionsmischung tropfenweise hinzufügen. Zum Mischen leicht schütteln und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren. 10 ml Medium pro Platte werden in einem Röhrchen inkubiert, wobei die Kappe zur Temperatur- und CO2 -Äquilibrierung gelockert wird.
- An Tag 3: Wechseln Sie das Medium vorsichtig mit dem vorinkubierten Medium und bringen Sie die Zellen wieder in den Inkubator zurück. Inkubieren Sie ein weiteres Röhrchen mit dem Medium und lösen Sie die Kappe. Hinweis: Synzytien oder die Bildung großer mehrkerniger Zellen können ein Zeichen dafür sein, dass die Verpackung gut läuft. Die Zellen befinden sich jedoch in einem fragilen Zustand und können leicht abgelöst werden. Wenn Sie das Medium wechseln, neigen Sie die Pipette so, dass sie horizontal ist, und geben Sie das Medium tropfenweise in eine Kante der Platte.
- An Tag 4: Ernten Sie das Virus, indem Sie das Medium mit einer Spritze entfernen und durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 μm in ein sauberes 50-ml-Röhrchen filtrieren. Ersetzen Sie das Medium vorsichtig durch das vorinkubierte Medium.
- An Tag 5: Ernten Sie erneut wie zuvor in Schritt 1.5.3.3 und mischen Sie das gängige Filtrat in dasselbe 50-ml-Röhrchen. Geben Sie 6 ml Viruskonzentrator in jedes Röhrchen und mischen Sie. Mindestens 24 Stunden bei 4 °C lagern, bis sich das Virus ausfällt.
Anmerkung: Je nach Gesundheit der Zellen kann das Virus ein drittes Mal geerntet werden.
- Das Virus wird durch Zentrifugieren bei 1.500 x g für 15 min bei 4 °C konzentriert. Der Überstand wird aspiriert und das Pellet wird in 250 μl Medium resuspendiert. Viren können sofort zur Infektion verwendet oder in 50 μl Aliquoten bei -80 °C bis zu einem Jahr gelagert werden.
- Füllen Sie etwa 3 x 105 U2OS- (oder Ziel-)Zellen pro Vertiefung in eine 6-Well-Platte (2 ml DMEM mit 10 % FBS pro Vertiefung) für die Infektion, so dass die Zellen zum Zeitpunkt der Infektion zu etwa 50 % konfluent sind.
- Entfernen Sie am nächsten Tag etwa die Hälfte des Mediums, so dass etwa 1 ml übrig bleibt. Koinfizieren Sie mit 50 μl konzentriertem Virus für jedes Konstrukt. 1 μl Polybren (8 mg/ml) in jede Vertiefung geben. Bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren. Wechseln Sie am nächsten Tag das Medium und inkubieren Sie noch einen Tag, bevor Sie das Antibiotikum auswählen.
Anmerkung: Die Menge des hinzuzufügenden Virus kann je nach gewünschter Infektionsrate variieren. Viren können mittels qRT-PCR titriert werden.
- Fügen Sie Antibiotika hinzu, um infizierte Zellen auszuwählen. Separate Vertiefungen mit nicht infizierten Zellen, die das Virus nicht gesehen haben, sind als Kanarienvögel erforderlich, um die Wirksamkeit der Selektion zu testen. Inkubieren Sie 2-7 Tage lang oder bis die Auswahl abgeschlossen ist.
Anmerkung: Wirksame Konzentrationen sollten zunächst titriert werden, liegen jedoch typischerweise bei 1,0 μg/ml für Puromycin und 1,0 mg/ml für Neomycin.
- Erweitern Sie die Zellen in eine größere 10-cm-Schale und fahren Sie mit Protokoll 2 fort.
2. Bildgebung fixierter Zellen
- Vorbereiten einer Probe für die Bildgebung
- Reinigen Sie einen 8-Well-Objektträger #1,5 mit Glasboden, indem Sie mindestens 1 Stunde lang 250 μl 1 M NaOH hinzufügen und gründlich mit PBS waschen.
Anmerkung: Unbehandelte Kammerdias führen in der Regel zu einem hohen Hintergrundsignal. Darüber hinaus können die Zellen empfindlich auf rückstandsmäßiges NaOH reagieren, und wenn die Glasoberfläche nicht gründlich gereinigt wird (bis zu 10x gewaschen), kann dies die Zelladhäsion erschweren. Falls erforderlich, inkubieren Sie den gereinigten Kammerobjektträger nach dem Waschen mit PBS O/N. Bei empfindlichen Zelllinien kann eine Beschichtung mit einer höheren Dichte (z. B. bei 50 % bis 60 % anfänglicher Konfluenz) hilfreich sein.
- Plattieren Sie etwa 5,5 x 104 der U2OS-stabilen Expressionszellen pro Well in 350 μl phenolrotfreiem DMEM mit 10 % FBS, damit die Zellen bei der Bildgebung gesund und nicht überkonfluent sind.
- Führen Sie die für das Experiment erforderlichen Behandlungen durch, z. B. die Zugabe von Tetracyclin, um die Proteinexpression zu induzieren.
- Fixieren Sie die Zellen unmittelbar vor der Bildgebung.
- Bereiten Sie vor der Fixierung frische Paraformaldehyd (PFA)-Lösung vor – 3,7 % PFA in 1x PHEM mit 0,1 % Glutaraldehyd (GA). Für 10 ml PFA-Lösung 0,37 g PFA wiegen und in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen. 1 ml destilliertes Wasser und 30 μl 1 M NaOH zugeben und vortexen. Bei 70 °C erhitzen und alle 1-2 min vortexen, bis sich das PFA vollständig aufgelöst hat.
- Gelöstes PFA in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführen und 3,8 ml destilliertes Wasser, 5 ml 2x PHEM-Puffer, 20 μl 25 % Glutaraldehyd und Vortex zum Mischen hinzufügen. Lager, 2x PHEM-Puffer besteht aus 120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA und 16 mM MgSO4, mit einem pH-Wert von 7,0 mit 10 M KOH. Diese Fixierlösung kann mehrere Tage bei 4 °C gelagert werden.
Vorsicht: PFA und GA sind beide gefährlich. Bereiten Sie die Lösung in einem Abzug vor und tragen Sie beim Umgang mit beiden Chemikalien die richtige Schutzausrüstung. Vermeiden Sie das Einatmen oder direkten Hautkontakt.
- Entfernen Sie das Wachstumsmedium. Schnell mit 500 μl PBS waschen und 250 μl des PFA-Fixiermittels pro Vertiefung hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei RT.
- Entfernen Sie das PFA-Fixiermittel aus der Probe und fügen Sie 350 μl PBS oder bildgebenden Puffer (100 mM Tris mit 30 mM NaCl und 20 mM MgCl2, pH 8,5) pro Vertiefung hinzu.
- Vortexen Sie 100 nm Goldpartikel zum Aufbrechen von Aggregaten und fügen Sie 35 μl pro Vertiefung (10x Endverdünnung) hinzu, um die Drift des Tisches während der Bildgebung zu verfolgen.
- Erfassen von Bildern
- Schalten Sie das Mikroskop ein. Schalten Sie die 405- und 561-nm-Laser ein, aber halten Sie die Verschlüsse (intern oder extern) zu diesem Zeitpunkt geschlossen. Schalten Sie die EMCCD-Kamera ein und lassen Sie sie abkühlen. Stellen Sie sicher, dass die 561-nm-Filter eingesetzt sind.
- Öffnen Sie die Erfassungssoftware und stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 ms und die EMCCD-Verstärkung auf 300 (Bereich 1 – 1.000) ein.
- Geben Sie Immersionsöl in das Objektiv und befestigen Sie die Probe auf dem Mikroskoptisch.
- Bringen Sie die Probe entweder mit einem Hellfeld oder dem eingeschalteten 561-nm-Laser (~1 kW/cm2 ) in den Fokus.
- Verwenden Sie für die Abbildung von Ras und anderen Membranproteinen ein 60-faches Apochromat-TIRF-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 1,49 und bringen Sie das Mikroskop in TIRF-Konfiguration. Stellen Sie den Anregungslaser so ein, dass er nicht zentriert ist, wenn er auf die hintere Apertur des TIRF-Objektivs trifft. Dies führt dazu, dass der Laser beim Erreichen der Probe abgelenkt wird. Stellen Sie den Laser so lange ein, bis der kritische Winkel erreicht ist und der Laser zurückreflektiert wird. Suchen Sie nach einer Zelle, die abgebildet werden soll und in der mehrere Goldpartikel angezeigt werden. Legen Sie einen Interessenbereich fest, der die Zelle (oder einen Bereich innerhalb der Zelle) und die Goldpartikel umschließt.
Hinweis: TIRF verringert die Eindringtiefe des Anregungslasers und reduziert das unscharfe Hintergrundsignal. Darüber hinaus ist die Driftkorrektur wahrscheinlich genauer, wenn mehr Goldpartikel sichtbar sind.
- Falls verfügbar, aktivieren Sie das Autofokussystem, um die Probendrift in z-Richtung zu korrigieren. Andernfalls passen Sie den Fokus während der gesamten Aufnahme manuell an, wenn das Bild unscharf wird.
- Beginnen Sie die Erfassung, wenn der 405-nm-Laser ausgeschaltet und der 561-nm-Laser eingeschaltet ist (~1 kW/cm 2), falls bereits eine ausreichende Aktivierung erfolgt (typischerweise bei hohen Expressionsniveaus). Andernfalls schalten Sie den 405-nm-Laser auf die niedrigste Werksleistungseinstellung (0,02 mW oder 0,01 W/cm2) ein und erhöhen Sie ihn nach Bedarf schrittweise (jeweils 0,1 mW), bis mehrere Dutzend Moleküle pro Bild vorhanden sind oder so dass die einzelnen Moleküle gut voneinander getrennt sind.
- Erhöhen Sie im Laufe der Datenerfassung schrittweise die Laserleistung von 405 nm, um die Punktdichte in etwa konstant zu halten. Hinweis: Bei einer niedrigeren Anregungsleistung von 405 nm kann bereits ein Teil von PAmCherry1 aktiviert werden. Wenn diese Moleküle Photobleiche erzeugen, nimmt die Population der verbleibenden photoaktivierbaren PAmCherry1-Moleküle ab, was einen höheren Photonenfluss erfordert, um die gleiche Dichte der Moleküle aufrechtzuerhalten, die in jedem Frame Fluoreszenz emittieren.
- Fahren Sie mit der Bildaufnahme fort, bis eine hohe Leistung von 405 nm (2,5 – 10 W/cm2) keine weiteren Aktivierungsereignisse mehr aktiviert.
Anmerkung: Die Gesamtaufnahmezeit hängt vom Expressionsgrad und der Effizienz der Komplementation ab.
Tabelle 1. Primer zur Linearisierung der Klonierung von Plasmiden, die PAmCherry1-Fragmente enthalten. Die klonierenden Plasmide, die RN und RC enthalten, können mit inverser PCR an der Insertionsstelle entweder am N- oder C-Terminus der Fragmente linearisiert werden. Die Sequenzen sind von 5' bis 3' aufgeführt.
| Primer-Sequenz (5' bis 3') |
| Klonierung des Plasmids für die Insertion am N-Terminus-Reverse | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN an der N-Endstation vorn | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC an der N-Endstation vorwärts | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| Klonierung des Plasmids für die Insertion am C-Terminus nach vorne | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| RN von der C-Endstation in umgekehrter Richtung | GTCCTCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC ab C-Endstation umgekehrt | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Tabelle 2. Überhänge für Primer des interessierenden Gens, die mit den Primern in Tabelle 1 übereinstimmen.
Die 15 Basenpaare der Homologie für die ligationsunabhängige Reaktion werden aus Primerüberhängen generiert. Zusätzlich enthalten die Überhänge die Sequenz für einen (GGGGS)x2 flexiblen Linker. Die flexible Linkersequenz kann stattdessen zu den Primern in Tabelle 1 hinzugefügt werden. Die Sequenzen sind von 5' bis 3' aufgeführt.
| Überhänge für die Primer des interessierenden Gens (5' bis 3') |
| N-Klemm-Einschub RN oder RC vorwärts | GAGCTCGGTACCATG |
| N-poliger Einschub RN umgekehrt | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCCCCTCGCCCCTTGCTCAC |
| N-Klemme Einschub RC Umkehr | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| C-Klemme Einschub RN vorwärts | ATGTACCCCGAGGACGGAGGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-Klemme Einschub RC vorwärts | GACGAGCTGTACAAGGGAGGGGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| C-Anschluss RN oder RC Reverse | GCGCCCACCCTTTTA |