Fluoreszenzanisotropie-basierter Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen

1. Markierung von SBDS-FlAsH mit dem FlAsH-Fluoreszenzfarbstoff 4',5'-Bis(1,3,2-dithioarsolan-2-yl)-fluorescein

1. Mischen Sie 3 nmol des SBDS-FlAsH-Proteins (der FlAsH-Tag entspricht dem Tetracystein-Motiv Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, das im C-Terminus des rekombinanten SBDS-Proteins gentechnisch verändert wurde) mit 3 nmol des 4',5'-bis(1,3,2-dithioarsolan-2-yl)-Fluorescein-Farbstoffs in 5 μl Volumen Anisotropiepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 10% Glycerin, 5 mM β-Mercaptoethanol).
2. Die Reaktion wird 8 Stunden lang bei 4 °C durchgeführt. Dialysieren Sie die Probe über Nacht gegen Anisotropiepuffer, um den freien Farbstoff zu entfernen.
3. Verwenden Sie das Lambert-Beer-Gesetz, um den Prozentsatz des markierten Proteins zu quantifizieren. Die Extinktion bei 280 nm und 508 nm wird in einem Spektralphotometer mit einer Quarzküvette mit entsprechendem Volumen gemessen. Anmerkung: Berücksichtigen Sie die folgenden molaren Absorptionskoeffizienten (^{M-1 cm-1}):
   Gleichung 1
4. Berechnen Sie die Konzentration des markierten SBDS-FlAsH-Proteins mit Hilfe von Gleichung 2.
   Gleichung 2
5. Berechnen Sie die Konzentration des gesamten SBDS-Proteins anhand von Gleichung 3, indem Sie das berechnete C_SBDS-FlAsH aus dem vorherigen Schritt ersetzen.
   Gleichung 3
6. Berechnen Sie den prozentualen Anteil des markierten Proteins mit Hilfe von Gleichung 4.
   Gleichung 4

2. Experimente zur Fluoreszenzanisotropie

HINWEIS: Anisotropieexperimente wurden in einem Spektrofluorometer durchgeführt, das mit einem Polarisationswerkzeugkasten ausgestattet ist, und die Datenerfassung wurde mit dem Anisotropieprogramm durchgeführt, das in der Software des Geräts bereitgestellt wird. Die Anregungswellenlänge wurde auf 494 nm mit einer spektralen Bandbreite von 8 nm eingestellt und die Emission mit einem Bandpassfilter von 530±25 nm aufgezeichnet. Die Messungen wurden bei 25 °C in einer 200 μl Küvette mit einer Schichtdicke von 5 mm durchgeführt.

1. In einer Fluoreszenzküvette werden 200 μl 30 nM SBDS-FlAsH in einen Anisotropiepuffer gegeben und 2 μl 30 μM EFL1 titriert. Gründlich mischen und die Reaktion 3 Minuten ruhen lassen, bevor der Anisotropiewert gemessen wird.
2. Schritt 2.1 wiederholen, bis ein Gesamtvolumen von 40 μl EFL1 zugegeben wurde.

3. Datenanalyse

1. Passen Sie die Daten mithilfe eines nichtlinearen Regressionsalgorithmus der kleinsten Quadrate an das entsprechende Bindungsmodell an. Gleichungen für die gebräuchlichsten Bindungsmodelle sind in Tabelle 1 dargestellt.
2. Evaluieren Sie das beste Modell, das die Wechselwirkung zwischen den Proteinen beschreibt, indem Sie die Residuen der Anpassung untersuchen. Unterstützen Sie das ausgewählte Modell mit zusätzlichen Experimenten.

Tabelle 1. Gängige Bindungsmodelle für Protein-Protein-Wechselwirkungen und die mathematischen Gleichungen, die sie beschreiben.