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>1. Bindungsreaktion und Elektrophorese
- Bereiten Sie 1 ml 5x Bindungspuffer vor, indem Sie 50 μl 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 μl 5 M NaCl; 200 μl 1 M KCl, 5 μl 1 M MgCl2, 10 μl 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 μl 1 M DTl; 25 μl 10 mg/ml BSA; und 695 μL ddH2O.
Anmerkung: Der 5x Binding Buffer kann aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden. Ein weiterer zu berücksichtigender Punkt ist, dass verschiedene Transkriptionsfaktoren unterschiedliche Modifikationen des Bindungspuffers aufweisen.
- Unmittelbar vor dem Einrichten von Bindungsreaktionen führen Sie das 5%ige Polyacrylamid-Gel in 0,5x TBE + 2,5% Glycerin vor, um alle Spuren von Ammoniumpersulfat bei 80 V für 30 - 60 min zu entfernen, oder bis der Strom nicht mehr mit der Zeit variiert.
- Richten Sie die Bindungsreaktion im Endvolumen von 20 μl ein.
- Mischen Sie 4 μl 5x Bindungspuffer, 80 - 200 ng gereinigtes Protein A (in 50 % Glycerin, d. h. SOX-2), 1 μl 0,1 μM Farbstoffkonjugierte Sonde (Endkonzentration: 5 nM) und ddH2O.
- Optional: Wenn Mitbewerber mit Kaltsonden benötigt werden, fügen Sie verschiedene Konzentrationen (2x, 10x, 25x, 50x, 100x usw.) von Kaltsonden hinzu.
- Optional: Wenn die Wechselwirkung zwischen den Proteinen A und B (d. h. SOX-2 und LIM-4) getestet ist, fügen Sie 80 - 200 ng gereinigtes Protein B (in 50 % Glycerin, d. h. LIM-4) hinzu.
- Optional: Wenn ein Kernextraktpräparat verwendet wird und die spezifische Bindung von Protein A validiert werden soll, fügen Sie einen Antikörper hinzu, der spezifisch für Protein A ist (d. h. anti-6xHis, anti-FLAG usw.).
- Inkubieren Sie bei R/T im Dunkeln für 15 min.
- Laden Sie alle Bindungsreaktionen auf das Gel und lassen Sie das Gel mit 10 V/cm bis zum gewünschten Abstand laufen.
>2. Bildgebung
HINWEIS: Das Gel wurde direkt in den Glasplatten mit einem fortschrittlichen Infrarot-Bildgebungssystem gescannt. Daher kann das Gel weiter aufgelöst und wiederholt gescannt werden (Abbildungen 1C und 2). Ein Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebungssystem, das hauptsächlich für Western-Blots bestimmt ist, wurde ebenfalls getestet, um das Gel zu scannen, aber nur das fortschrittliche Infrarot-Bildgebungssystem war in der Lage, das Gel mit guter Auflösung zu scannen. Die beschriebene Methodik ist spezifisch für eine bestimmte Infrarot-Bildgebungssoftware, obwohl auch andere Softwarepakete verwendet werden können.
- Reinigen Sie das Bett des Scanners mit ddH2O und trocknen Sie es vor dem Scannen gut ab. Wischen Sie die Glasplatten des Gels trocken und legen Sie die Platten mit dem Gel auf das Scannerbett.
- Öffnen Sie die Infrarot-Bildgebungssoftware und gehen Sie auf die Registerkarte "Erwerben". Wenn die dünnere Platte (1 mm) auf das Scannerbett gelegt wird, verwenden Sie die Einstellungen für Kanal: 700, Intensität: Auto, Auflösung: 169 μm, Qualität: mittel und Fokusversatz: 1,5 mm. Wenn die dickere Platte (3 mm) auf das Scannerbett gelegt wird, verwenden Sie die Einstellungen für Kanal: 700, Intensität: Auto, Auflösung: 84 μm, Qualität: mittel und Fokusversatz: 3,5 mm. Der Fokusversatz hängt von der Dicke der Glasplatte ab.
- Wählen Sie den Bereich aus, den das Gel auf dem Scanner einnimmt. Klicken Sie auf "Start", um den Scan zu starten.
