Elektrophoretischer Mobilitäts-Shift-Assay zum Nachweis von Transkriptionsfaktor-DNA-Komplexen

Zusammenfassung

Quelle: Hsieh, Y. W. et al., Ein optimiertes Protokoll für elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotiden. J. Vis. (2016)

In diesem Video demonstrieren wir den elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassay zum Nachweis von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Infrarot-Fluoreszenz-markierten DNA-Sonden. Wenn das Protein an die DNA-Sonde bindet, bildet es einen großen Komplex, der langsam weiterwandert und als verschobene Bande auf dem Gel erscheint.

Protokoll

>1. Bindungsreaktion und Elektrophorese

1. Bereiten Sie 1 ml 5x Bindungspuffer vor, indem Sie 50 μl 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 μl 5 M NaCl; 200 μl 1 M KCl, 5 μl 1 M MgCl₂, 10 μl 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 μl 1 M DTl; 25 μl 10 mg/ml BSA; und 695 μL ddH₂O.
   Anmerkung: Der 5x Binding Buffer kann aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden. Ein weiterer zu berücksichtigender Punkt ist, dass verschiedene Transkriptionsfaktoren unterschiedliche Modifikationen des Bindungspuffers aufweisen.
2. Unmittelbar vor dem Einrichten von Bindungsreaktionen führen Sie das 5%ige Polyacrylamid-Gel in 0,5x TBE + 2,5% Gl....

Ergebnisse

Abbildung 1. fEMSA unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotiden. (A) Flussdiagramm der fEMSA. (B) Die Wirkung des Farbstoffs Bromphenolblau, des orangefarbenen G und des dI-dC (1 μg) auf fEMSA. Es wurden 5 nM 5'Dye-LIM-4/SOX-2-Sonde verwendet. (C)fEMSA, das eine Bindungsspezifität von 6xHis-SOX-2^G73E an die SOX-2-Zielstelle des LIM-4/SO.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
30% Acrylamid/Bis-Lösung, 37,5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamid ist schädlich und giftig.
Rinderserumalbumin in molekularbiologischer Qualität	Neuengland Biolabore	B9000S
5'IRDye700-markierte DNA-Oligos	Integrierte DNA-Technologien	Kundenspezifisches DNA-Oligo	Diese werden im Manuskript als 5'-Farbstoff-markierte oder infrarotfluoreszierende Farbstoff-markierte DNA-Oligos bezeichnet. Das Unternehmen wird 5'-IRDye-markierte DNA-Oligonukleotide kundenspezifisch synthetisieren. Erfordert mindestens eine Synthese im 100-μM-Maßstab und eine HPLC-Aufreinigung.
Mini-PROTEAN Vertikale Elektrophoresezelle	Bio-Rad	Artikel-Nr.: 1658000FC	Gerät
Odyssey CLx Infrarot-Bildgebungssystem	LI-COR Biotechnologie	Odyssey CLx Infrarot-Imagng-System	Gerät
Odyssey Fc Bildgebungssystem	LI-COR Biotechnologie	Odyssey Fc Dual-Mode-Bildgebungssystem	Gerät
Image Studio-Software (Version 4.0)	LI-COR Biotechnologie	Image Studio-Software	Software
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G	chemisch
6x Orange Ladefarbe			0,25 % Orange G; 30 % Glycerin
0,5x TBE			45 mM Tris-Borat; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8,0
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8,0; 1 mM EDTA
5x Bindungspuffer			50 mM Tris-HCl, pH7,5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8,0; 5 mM DTT; 250 μg/ml BSA