Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Reinigung von PDGFRα-positiven Oligodendrozyten-Linienzellen aus dem Gehirn von Mäusen (modifiziert von zuvor beschriebenen Immunpanning-Protokollen)
- Herstellung einer Immunpanning-Platte für die PDGFRα-positive Zellselektion und von 2 Platten für die Depletion von Endothelzellen und Mikroglia.
Anmerkung: Bitte beachten Sie, dass Petrischale, aber keine Zellkulturschalen für Immunpanning-Experimente geeignet sind. Wenn die gereinigten Zellen für die Kultivierung verwendet werden sollen, müssen die Immuntransplantationsschritte in der Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden
- Eine 10 cm große Petriplatte mit 30 μl Ziegen-Anti-Ratten-IgG in 10 ml pH 9,5, 50 mM Tris-HCl über Nacht bei 4 °C beschichten. Rühren Sie die Platte, um sicherzustellen, dass die Oberflächen der Platten gleichmäßig und vollständig von der Beschichtungslösung bedeckt sind.
- Bereiten Sie PDGFRα-Antikörperlösung vor, indem Sie 40 μl Anti-PDGFRα-Antikörper für Ratten mit 12 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) mit 0,2 % BSA verdünnen.
- Nach 3 Wäschen der IgG-beschichteten Platte mit je 10 mL 1x DPBS die IgG-beschichtete Platte mit PDGFRα-Antikörperlösung bei Raumtemperatur für 4 h inkubieren.
- Waschen Sie die mit Anti-PDGFRα-Antikörpern beschichtete Rattenplatte 3 Mal mit je 10 mL 1x DPBS. Geben Sie die DPBS-Lösung vorsichtig entlang der Seitenwand der Platte und stören Sie die beschichteten Oberflächen nicht.
- 2 neue 15 cm Petriplatten für die Depletion von Endothelzellen und Mikroglia mit 20 mL DPBS beschichten, die 2,3 μg/mL Banderiaea simplicifolia Lektin 1 (BSL-1) für 2 h enthalten.
- Waschen Sie die BSL-1 beschichteten Platten 3 Mal mit 20 mL 1x DPBS. Geben Sie die DPBS-Lösung vorsichtig entlang der Seitenwand der Platten und stören Sie die beschichteten Oberflächen nicht.
- Die Aufreinigung von PDGFRα-positiven Zellen der Oligodendrozytenlinie wird gegenüber zuvor veröffentlichten Methoden modifiziert.
- Präparieren Sie das kortikale Gewebe von 2 Mäusegehirnen am postnatalen Tag 7 (P7) gemäß den zuvor veröffentlichten Protokollen.
- Dissoziieren Sie das Gewebe, um eine einzellige Suspension mit einem Dissoziationskit für das Nervengewebe (P) gemäß den detaillierten Anweisungen des Herstellers zu erzeugen.
- Schneiden Sie das präparierte kortikale Gewebe kurz mit einem Skalpell in Stücke und unterziehen Sie es einer enzymatischen Verdauung bei 37 °C. Nach dem Aufschluss werden die Stücke manuell mit Pasteur-Pipetten aus feuerpoliertem Glas in eine einzellige Suspension dissoziiert.
- Zentrifugieren Sie die Einzelzellsuspension bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur und suspendieren Sie das Zellpellet mit 15 mL Immunpanning-Puffer (Immunpanning-Puffer ist DPBS mit 0,02 % BSA und 5 μg/mL Insulin).
- Inkubieren Sie die Einzelzellsuspension aus 2 Mausgehirnen nacheinander 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf 2 BSL-1-beschichteten Platten, wobei die Platte alle 5 Minuten sanft bewegt wird, um eine bessere Depletion von Mikroglia- und Endothelzellen zu gewährleisten.
- Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die nicht adhärenten Zellen in der Zellsuspension zu sammeln, und inkubieren Sie sie auf der mit Ratten-PDGFRα-Antikörpern beschichteten Platte für 45 Minuten bei Raumtemperatur.
- Nach der Inkubation der Zellsuspension auf der mit Ratten-PDGFRα-Antikörpern beschichteten Platte schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Zellsuspension aufzufangen, und spülen Sie die Platte 8 Mal mit DPBS aus, um nicht adhärente Zellen zu entfernen. Geben Sie vorsichtig Waschlösung entlang der Seitenwand der Platte hinzu und rühren Sie die Platte mehrmals um, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen.
- Die Zellen werden von der mit Ratten-PDGFRα-Antikörpern beschichteten Platte mit einer 4 ml Zellablösungsbehandlung für 10 Minuten bei 37 °C gelöst. Die Platte wird geschüttelt, um adhärente Zellen zu entfernen.
- Sammeln Sie die gereinigten OPCs durch Zentrifugation bei 300 x g bei Raumtemperatur, suspendieren Sie das Zellpellet mit 2 mL OPC-Zellkulturmedium und zählen Sie die Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer (500 mL Zellkulturmedium in DMEM/F12 Medium mit 5 mL Penicillin-Streptomycin-Lösung (P/S), 5 mL N2, 10 mL B27, 5 μg/ml Insulin, 0,1 % BSA, 20 ng/ml bFGF und 10 ng/ml PDGFRα).
- Validierung der Reinheit von OPCs nach Immunpanning.
- Um die Anreicherung von OPCs nach Immunpanning zu bewerten, verwenden Sie einige der gereinigten OPCs für die RNA-Extraktion mit einer Extraktion auf Guanidiumthiocyanat-Basis gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Durchführung einer qRT-PCR unter Verwendung eines fluoreszierenden grünen Farbstoff-Mastermixes, um die Anreicherung der PDGFRα-Expression in gereinigten OPCs im Vergleich zu dissoziierten Gehirnzellen gemäß den zuvor veröffentlichten Materialien zu überprüfen.
- Zusätzlich werden einige gereinigte OPCs in die Poly-D-Lysin-beschichteten 24-Well-Platten für die Immunfärbung mit Anti-NG2-Chondroitinsulfat-Proteoglykan-Antikörpern (NG2) eingeimpft, wie zuvor veröffentlichte Materialien verwendet.
>2. ChIP-Vorbereitung mit niedrigen Zellen und Aufbau von ChIP-Bibliotheken für die Hochdurchsatz-Sequenzierung
- Olig2 Präparation von Low-Cell ChIP mit einem kommerziell erhältlichen Beschallungssystem und einem kommerziell erhältlichen ChIP-Kit mit niedriger Zellzahl (siehe Materialtabelle) unter Befolgung der detaillierten Standardverfahren in den Anweisungen des Herstellers.
- Nach dem Lösen von der mit Anti-PDGFRα-Antikörpern beschichteten Platte der Ratte und der Zellzählung mit Trypanblau und einem Hämozytometer wurden für jede ChIP-Reaktion 20.000 gereinigte OPCs in 1 ml OPC-Zellkulturmedium gegeben.
- Fügen Sie 27 μl 36,5 % Formaldehyd hinzu, um die Zellsuspension 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zu fixieren.
Vorsicht: Bitte beachten Sie, dass Formaldehyd aus Sicherheitsgründen im chemischen Abzug verwendet werden muss.
- Stoppen Sie die DNA-Protein-Vernetzung mit 50 μL 2,5 M Glycin für 5 min bei Raumtemperatur.
Anmerkung: Ab diesem Zeitpunkt müssen alle Arbeitsschritte auf Eis oder in einem 4 °C kalten Raum durchgeführt werden.
- Waschen Sie die vernetzten Zellpellets mit 1 mL eiskalter Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) mit Proteaseinhibitor-Cocktail und lassen Sie die Zellen mit einer vorgekühlten Zentrifuge bei 300 x g bei 4 °C pelletieren.
- Lysieren Sie das Zellpellet in 25 μl vollständigem Lysepuffer für 5 min auf Eis.
Anmerkung: Bewegen Sie das Röhrchen, um die Zellen in Lysepuffer zu suspendieren.
- Ergänzen Sie das Zelllysat mit 75 μl eiskaltem HBSS-haltigem Proteaseinhibitor-Cocktail und scheren Sie das Chromatin des Zelllysats durch ein vorgekühltes Beschallungssystem mit 5 Zyklen von 30 s EIN und 30 s AUS. Beschallen Sie immer 6 Röhrchen zusammen und stellen Sie sicher, dass die Waagenröhrchen 100 μl Wasser enthalten.
- Nach der Scherung bei 14.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und nach der Zentrifugation den Überstand in einem neuen Röhrchen auffangen.
- Verdünnen Sie 100 μl geschertes Chromatin mit einem gleichen Volumen eiskaltem vollständigem ChIP-Puffer mit dem Proteaseinhibitor.
- Bewahren Sie 20 μl des verdünnten gescherten Chromatins als Eingangskontrollprobe auf.
Anmerkung: Eine Eingangskontrollprobe ist ebenfalls erforderlich, da der Vergleich mit der immunpräzipitierten Olig2-Probe zur Identifizierung der immunpräzipitierten Olig2-Antikörper-DNA erfolgt.
- 1 μl Kaninchen-Anti-Olig2-Antikörper werden zu 180 μl des verdünnten gescherten Chromatins hinzugefügt und das Reaktionsgefäß auf einem rotierenden Rad bei 40 U/min für 16 Stunden bei 4 °C inkubiert.
Anmerkung: Führen Sie diesen Schritt in einem Kühlraum durch.
- Waschen Sie für jede ChIP-Reaktion 11 μl magnetische Protein A-beschichtete Kügelchen mit 55 μl Beads Wash Buffer und legen Sie das Bead-Pellet nach 2 Wäschen in 11 μl Bead Wash Buffer.
Anmerkung: Führen Sie diesen Schritt in einem Kühlraum durch.
- Geben Sie für jede ChIP-Reaktion 10 μl vorgewaschene Protein A-beschichtete Kügelchen in das ChIP-Reaktionsröhrchen. Führen Sie diesen Schritt in einem Kühlraum durch.
- Das ChIP-Reaktionsröhrchen wird bei 4 °C für weitere 2 h auf einem rotierenden Rad inkubiert.
- Legen Sie das ChIP-Reaktionsröhrchen für 1 Min. auf das Magnetgestell
Anmerkung: Führen Sie diesen Schritt in einem Kühlraum durch.
- Entfernen Sie den Überstand und lösen Sie das Kügelchen nicht.
- Waschen Sie das Bead-Pellet mit 100 μL für jeden der 4 Waschpuffer jeweils für 4 min auf einem rotierenden Rad bei 4 °C.
- Geben Sie nach dem Waschen 200 μl Elutionspuffer in das Bead-Pellet und inkubieren Sie das ChIP-Reaktionsröhrchen 4 Stunden lang bei 65 °C, um die Vernetzung der Protein-DNA umzukehren.
- Zusätzlich 180 μl Elutionspuffer in die 20 μl Eingangskontrollprobe geben und 4 Stunden lang bei 65 °C inkubieren, um auch die Protein-DNA umzukehren.
- 200 μl 25:24:1 (v/v) Gemisch aus Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol in jedes ChIP-Reaktionsröhrchen geben.
- 1 min kräftig vortexen und 15 min bei Raumtemperatur bei 13.000 x g zentrifugieren. Übertragen Sie die obere Phase auf ein neues Rohr.
- Über Nacht bei -20 °C werden 40 μl 3 M Natriumacetatlösung, 1.000 μl 100 % Ethanol und 2 μl Glykogenfällungsmittel, das kovalent an einen blauen Farbstoff gebunden ist, in jedes ChIP-Reaktionsröhrchen gegeben.
- Zentrifugieren Sie bei 13.000 x g für 20 min bei 4 °C.
- Den Überstand entsorgen, mit 500 μl kaltem 70%igem Ethanol waschen und bei 13.000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den Überstand, halten Sie das Pellet 10 Minuten lang an der Luft und lösen Sie das Pellet mit 50 μl Wasser auf.
- Aufbau einer ChIP-Bibliothek für die Hochdurchsatz-Sequenzierung
- Reinigen und konzentrieren Sie die ChIP-DNA mit einem Clean-up-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Quantifizieren Sie die ChIP-Probe mit einem Pico-Grün gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Verwenden Sie ein ChIP-seq-Kit für T-Tailing, Replikation und Tailing, Template-Switching und -Erweiterung, das Hinzufügen von Adaptern und Amplifikation, die Auswahl der Bibliotheksgröße und die Reinigung gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Nach der Denaturierung der dsDNA wird das 3'-Ende der ssDNA durch alkalische Phosphatase der Garnelen dephosphoryliert und der ssDNA ein Poly (T)-Schwanz durch terminale Desoxynukleotidyltransferase hinzugefügt.
- Annealen Sie den DNA Poly (dA) Primer an das ssDNA-Template für die DNA-Replikation und den Template-Switching.
- Nach dem Template-Switching amplifizieren Sie die ChIP-seq-Bibliothek durch PCR mit den Forward- und Reverse-Primern für die Indizierung.
- Wählen Sie die PCR-amplifizierte ChIP-seq-Bibliothek mit Fragmenten im Bereich von 250 bis 500 bp durch paramagnetische Beads mit Option 2 für die doppelte Größenauswahl.
- Untersuchen Sie die Qualität der ausgewählten ChIP-seq-Bibliothek mit einem mikrofluidischen Chip-Kapillar-Elektrophorese-Gerät.