>1. Polarisationsmikroskopie
- Für die Weitfeld-Laserbeleuchtung fokussieren Sie eine 638-nm-Linie eines kontinuierlichen Diodenlasers (40 mW) auf die Apertur der Multimode-Glasfaser für die Strahlreinigung. Montieren Sie einen linearen Polarisator am Ausgang der Faser, um die Polarisation des Laserlichts einzustellen.
- Die Anregungskomponente des emittierten Lichts wird mit einem dichroitischen Spiegel (640 nm Cut-off) und einem Bandpassfilter (Bandpass 700/75) blockiert.
- Lassen Sie das Fluoreszenzsignal durch einen polarisierenden Strahlteiler passieren, der das emittierte Licht in seine senkrechten und parallel polarisierten Komponenten aufspaltet. Fokussieren Sie dann den nicht reflektierten Strahl (parallele Komponente) und den reflektierten Strahl (senkrechte Komponente) mit einer achromatischen Linse von 200 mm Brennweite auf den Chip einer rückwärtig belichteten EM-CCD-Kamera (Abbildung 1b und 1c). Verwenden Sie einen Spiegel, um die Richtung des senkrechten Strahls in Richtung der Linse einzustellen.
>2. Design und Prüfung von fluoreszenzmarkierten Referenz-DNA-Oligomeren
- Bestimmung der Kernsequenz der Referenz-DNA: Die Methode basiert auf einem kompetitiven Assay, der die Dissoziationskonstante (KD2) zwischen einem Transkriptionsfaktor und einem unmarkierten Konkurrenz-DNA-Oligomer misst, das um die Bindung an eine fluoreszenzmarkierte DNA konkurriert, deren Affinität zum TF als Referenz fungiert (KD1). Als Ausgangspunkt kann die Konsensussequenz dienen, die aus anderen Quellen wie DNase-Footprinting oder bakteriellem 1-Hybrid gewonnen wurde.
Anmerkung: Als Faustregel gilt, dass eine geeignete Referenz-DNA eine 3- bis 7-fache Abnahme der Bindungsaffinität zur TF im Vergleich zur Konsensussequenz aufweist.
- Messen Sie mittels HiP-FA die KD1s von 2-3 vorläufigen Einzelmutationen der Konsensussequenz, die im vorherigen Schritt abgeleitet wurde. Versuchen Sie, Positionen in Konsenssequenzen zu mutieren, die nicht zu spezifisch sind, um einen vollständigen Verlust der Bindung zu vermeiden.
Anmerkung: Es ist wichtig, dass die Referenzsequenz an den interessierenden Transkriptionsfaktor (den wir in diesem Protokoll Giant Gt verwendet haben) gebunden ist, aber nicht zu stark, damit schwächere Konkurrenten ihn bei hohen Konzentrationen ausstechen können.
- Verlängern Sie das Kernmotiv (in der Regel 8-12 Basenpaare) auf eine Länge von 16 Basenpaaren oder mehr, indem Sie an beiden Seiten eine symmetrisch flankierende Sequenz hinzufügen (fügen Sie Seitenketten für eine korrekte Bindung hinzu). Falls erforderlich (z. B. für längere Bindungsdomänen), verwenden Sie längere Sequenzen (bis zu ~50 Basenpaare mit der Länge wurden mit dem HiP-FA-Assay getestet).
Vorsicht: Achten Sie darauf, keine Basen hinzuzufügen, von denen erwartet wird, dass sie ektopische Bindungsstellen erzeugen. Verwenden Sie Berechnungstools, die Bindungsstellen aus verfügbaren PWMs vorhersagen, um diesen Prozess zu erleichtern (z. B. PySite).
- Ordnen Sie als markierte Referenz-DNA Oligomere an, die fluoreszenzmarkiert sind, entweder auf dem Vorwärts- oder Rückwärtsstrang am 3'- oder 5'-Ende. Verwenden Sie beispielsweise Cy5, Bodipy-650 oder einen anderen geeigneten Farbstoff in einer Konzentration von 10 μM (100 μM 10x Stoff) in Wasser und verdünnen Sie ihn schrittweise wie in Schritt 3.1 beschrieben.
- Bereiten Sie 500 ml 1x Bindungspuffer vor, indem Sie 33 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,0), 90 mM NaCl und 0,01 % nichtionisches Detergens in destilliertem Wasser hinzufügen. Bereiten Sie auch 3x Bindungspuffer vor, der die gleichen Komponenten enthält, außer in dreifacher Konzentration. Wenn Sie 3x Bindungspuffer als Stammlösung für den 1x Bindungspuffer verwenden, bereiten Sie Volumina > 500 ml vor; Andernfalls bereiten Sie 250 mL
Anmerkung: Diese Zusammensetzung wurde für die Stabilität des Transkriptionsfaktors und zur Verhinderung der Dimerisierung der Glutathion-S-Transferase (GST) optimiert.
- Messen Sie mit dem in Schritt 1 beschriebenen Mikroskopieaufbau die FA von 200 μl Bindungspuffer mit 0,8 nM markierter Referenz-DNA in Gegenwart unterschiedlicher Mengen an TF in einer 96-Well-Glasbodenmikroskopieplatte (5-6 Wells mit unterschiedlichen TF-Konzentrationen), um die zu verwendende TF-Konzentration zu bestimmen. Es wird eine Titrationsreihe mit zunehmenden Mengen an TF durchgeführt und für den Assay die Konzentration gewählt, für die die Kurve ein Plateau erreicht, was auf eine vollständige Bindung des DNA-Referenzoligomers hinweist.
Anmerkung: Die optimale TF-Konzentration hängt von den Werten der TF-DNA-Dissoziationskonstanten ab. Im Allgemeinen erfordern niedrigere KDs niedrigere Konzentrationen.
>3. Oligomer-Glühen
- Um die DNA-Oligomere der markierten Referenz-DNA (Sequenz im vorherigen Schritt bestimmt) zu annealisieren, mischen Sie 7 μl einer 10 mM Farbstoff-markierten vorwärts einzelsträngigen DNA-Lösung und 7 μL einer 10 mM-Konzentration ihres unmarkierten umgekehrten Komplements in 186 μl Wasser.
- Für die DNA-Sequenzen von Mitbewerbern werden 20 μl 100 mM-Lösungen (in Wasser, vom Hersteller bereitgestellt) vorwärts einzelsträngiger DNA mit 20 μl 100 mM der entsprechenden umgekehrten einzelsträngigen DNA für jede einzelne zu messende Sequenz von Mitbewerbern gemischt.
- Führen Sie das Glühen separat in einem Standard-PCR-Cycler durch, indem Sie die Lösungen 3 Minuten lang auf 70 °C erhitzen und die Temperatur mit einer Geschwindigkeit von 0,1 K/s auf RT senken. Wenn das verwendete PCR-Gerät keine Temperaturgradienten in dieser Geschwindigkeit unterstützt, führen Sie einfach schrittweise Inkubationen mit abnehmenden Temperaturen durch (getestet wurden 99 Zyklen à 3 s mit -0,4 K pro Zyklus).
>4. Gel-Vorbereitung
HINWEIS: Der folgende Abschnitt erklärt die Herstellung von zwei verschiedenen Arten von Gelen: 1) Die Titrationsvertiefungen enthalten Gele mit Protein und werden verwendet, um die KDs für die jeweiligen konkurrierenden DNA-Sequenzen zu bestimmen, und 2) die Kalibriervertiefungen verwenden NB, um die DNA-Konzentration zu jedem gegebenen Zeitpunkt und jeder gegebenen Aufnahmehöhe zu bestimmen. Der Fokus liegt auf der Vorbereitung des Experiments in einer 96-Well-Platte, aber auch die entsprechenden Volumina für ein 384-Well-Plattenformat sind angegeben.
- Lösen Sie 0,5 % w/v Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt im Bindungspuffer, indem Sie es in einer Labormikrowelle kochen. Nach vollständiger Auflösung das Volumen erneut mit ddH2O einstellen, um eine mögliche Verdunstung auszugleichen.
Anmerkung: Bereiten Sie der Einfachheit halber einen Vorrat von 10-20 10 mL Aliquots der Gele vor und schmelzen Sie sie bei Bedarf bei 75 °C. Gel-Aktien können unter RT.
gelagert werden.
Vorsicht: Achten Sie darauf, dass die Gellösung in der Mikrowelle nicht überhitzt wird. Kurze Aufheizzeitintervalle mit zwischendurch Schütteln sind wünschenswert.
- Zur Vorbereitung von Titrations- und Kalibriervertiefungen schmelzen Sie zunächst zwei 10-ml-Gelmaterialaliquote bei 75 °C unter Schütteln.
- Verwenden Sie 240 μl (einschließlich 20 % Overhead) für jeden Mitbewerber (n = Anzahl der Sequenzen des Mitbewerbers).
- Verwenden Sie das gleiche Gelvolumen für die NB-Kalibriervertiefung, um eine gleiche Temperatur und Viskosität beider Gele zu gewährleisten.
- Stellen Sie dann die Temperatur auf 35 °C ein und warten Sie, bis sich die Temperatur ausgeglichen hat.
- Für die Titrationsvertiefungen werden 1,4 nM (Endkonzentration) hybridisierte Referenz-DNA (in Schritt 3 erhalten), TF-Protein (Endkonzentration CTF = 20-60 nM, wie in Schritt 2.6 bestimmt), DTT (0,2 mM) und Bindungspuffer in einem Gesamtvolumen von n x 200 μl oder n x 13 μl in einem 96- oder 384-Well-Plattenformat zugegeben. (zuzüglich Gemeinkosten). Durch Umkehren/Schütteln gründlich mischen (nicht vortexen).
- Geben Sie langsam 200 μl pro Vertiefung im 96-Well-Plattenformat (13 μl/Vertiefung für 386 Vertiefungen) der im vorherigen Schritt hergestellten Gellösung in die Titrationsvertiefungen der Vertiefungsplatte.
- Für die Kalibriervertiefungen geben Sie zunächst 5 nM NB zu dem geschmolzenen Gel außerhalb der Vertiefungen (Gesamtvolumen abhängig vom verwendeten Well-Plattenformat und von der Anzahl der Kalibrierwells; in der Regel sind 5-6 pro Well-Platte ausreichend).
- Pipettieren Sie 200 μl (13 μl für das 384-Well-Plattenformat) NB-haltiges Gel langsam in die Titrationsvertiefungen der Well-Platte und achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden.
Anmerkung: Der Einsatz von elektronischen Pipetten oder Robotik erhöht die Reproduzierbarkeit erheblich.
- Lassen Sie das Gel 10 min bei RT und weitere 10 min bei 4 °C fest werden (anschließend ggf. Kondenswasser vom Glas entfernen). Achten Sie darauf, dass Sie alle diese Schritte auf einer perfekt waagerechten Oberfläche durchführen, um inhomogene Geloberflächen zu vermeiden.
Anmerkung: Die proteinhaltigen Gele sind in der Regel mindestens mehrere Stunden bei 4 °C stabil.
>5. Hinzufügen der Competitor DNA-Lösung
HINWEIS: Die folgenden Lösungen sollten vor Beginn der Titration zubereitet werden und werden gleichzeitig auf die Kalibrier- und Titrationsvertiefungen gegeben.
- Fügen Sie die geglühte, markierte Referenz-DNA und das Protein in 3x Bindungspuffer in 3-mal höheren Konzentrationen als die Gel-Stamm-Aliquote hinzu.
- Mischen Sie 20 μl der erhaltenen Lösung mit 40 μl jeder in Schritt 3 erhaltenen geglühten DNA-Lösung von Mitbewerbern.
- Mischen Sie für jede Kalibriervertiefung 20 μl 3x Bindungspuffer mit 15 mM NB-Lösung mit 40 μl getemperter Konkurrenz-DNA (jede Sequenz gleicher Länge ist geeignet).
Anmerkung: Verwenden Sie für die 384-Well-Platten insgesamt 21 μl anstelle von 60 μl.
- Optional können Sie die Homogenität der Gelhöhen in den verschiedenen Vertiefungen der Platte spektroskopisch überprüfen, indem Sie die Extinktion bei 380 nm mit einem Multi-Well-Plattenleser messen (die Absorptionswerte sind proportional zu den Gelhöhen).
- Geben Sie 50 μl (7 μl für das 384-Well-Plattenformat) der gemischten DNA-Lösungen der Wettbewerber (in Schritt 3 geglüht) auf die Gele. Versuchen Sie, alle Lösungen von Mitbewerbern so schnell wie möglich gleichzeitig hinzuzufügen, indem Sie elektronische Mehrkanalpipetten oder einen 96-Kanal-Pipettierkopf verwenden, falls verfügbar. Nach der Zugabe der Konkurrenzlösungen legen Sie die Platte auf den Mikroskoptisch und beginnen sofort mit den Messungen.
>6. Bilderfassung
- Erfassen Sie sequenziell Zeitreihen von Z-Stacks (z. B. verwenden Sie 12 Ebenen und 100-300 ms Beleuchtungszeit). Vermeiden Sie es, Bilder zu nahe an der Well-Oberfläche aufzunehmen (< ~1,4 μm mit den hier verwendeten Platten), um eine Polarisationsverzerrung auszuschließen.
- Führen Sie 10-25 Messzyklen durch, bis die Bindung der markierten Referenz-DNA an die TF vollständig gelöst ist. Der Endpunkt wird in der Regel nach 1-2 Stunden erreicht, abhängig von der Bindungskinetik und der Diffusivität der Konkurrenz-DNA.
