Reportergen-Repressionsassay zur Untersuchung der translationalen Regulation eines Zielgens

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Katz, N., et al. Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt einen in vivo Assay in Bakterien, um die Interaktion von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) mit RNA zu untersuchen. Die Bakterienzellen werden mit zwei Plasmidkonstrukten transformiert – einem Plasmid an der Bindungsstelle, das für eine mRNA kodiert, die ein fluoreszierendes Reportergen stromabwärts einer RBP-Bindungsstelle enthält –, während ein RBP-Plasmid die RBP-Proteine unter der Kontrolle eines Induktors exprimiert. Bei einer durch Induktoren vermittelten Erhöhung der RBP-Produktion binden die RBPs an die mRNA, was zu einer translationalen Repression des Reporters durch Hemmung der Ribosomenbindung führt.

Protokoll

>1. Vorbereitung des Systems

Design von Plasmiden an der Bindungsstelle
1. Entwerfen Sie die Kassette für die Bindungsstelle, wie in Abbildung 1 dargestellt. Jedes Minigen enthält die folgenden Teile (5' bis 3'): Eagl-Restriktionsstelle, ∼40 Basen des 5'-Endes des Kanamycin (Kan)-Resistenzgens, pLac-Ara-Promotor, Ribosomen-Bindungsstelle (RBS), AUG des mCherry-Gens, einen Spacer (δ), eine RBP-Bindungsstelle, 80 Basen des 5'-Endes des mCherry-Gens, und eine ApaLI-Einschränkungsseite.
  Anmerkung: Um die Erfolgsrate des Assays zu erhöhen, entwerfen Sie für jede Bindungsstelle ....

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Überblick über das Systemdesign und die Klonierungsschritte. Illustration des Kassettendesigns für das Plasmid an der Bindungsstelle (links) und das RBP-mCerulean-Plasmid (rechts). Der nächste Schritt ist die sukzessive Transformation beider Plasmide in kompetente E. coli-Zellen, wobei zuerst RBP-Plasmide verwendet werden. Doppeltransformatoren werden dann auf ihre mCherry-Ex.......